Cuba

Se empleó un crudo de ácido hialurónico (AH) extraído del cordón umbilical de placentas humanas, para evaluar el efecto farmacológico de una jalea cicatrizante. Se realizó un diseño experimental con 20 ratas hembras adultas como modelo biológico. A cada una se les provocó 4 heridas en la región dorsal con un biótomo de 9 mm de diámetro, donde se aplicaron los 4 tratamientos a evaluar: control (C), placebo (P), sulfadiacina de plata (SP) y jalea de AH al 4 % (AH). Se trataron por 7 días y diariamente se observó la clínica de las heridas. Al séptimo día los animales se sacrificaron, tomándose muestras de las heridas para el estudio histopatológico por la técnica clásica de inclusión en parafina con doble tinción de hematoxilina-eosina (H-E) y la tricrómica de Masson y para un estudio de planimetría a través un software de tratamiento de imágenes. El producto evaluado (AH) evidenció una mejor respuesta respecto a los demás tratamientos del ensayo al poseer un 70 % de las muestras con heridas cerradas en la migración epitelial y poseer en la reconstitución dérmica un 50 % en grado II y un 20 % en grado III, lo que demuestra una matriz con fibras colágenas más madura que los demás. En el estudio de planimetría este tratamiento también fue el de mejor evolución con un 89.33 % de área re-epitelizada, un menor perímetro de la herida con l0.32mm y el de mayor crecimiento lineal con 5.5mm y una circularidad menor de 61.33. Se concluye que la Jalea de Acido Hialurónico al 4 % es un fármaco que contribuye a acelerar la cicatrización en el biomodelo ensayado.

La piel constituye una barrera protectora contra el medio externo, y ante cualquier daño o lesión producida en la misma busca alguna solución para ser reparada de forma inmediata. Los eventos de la cicatrización de heridas atraviesan por diferentes pasos, siendo el proceso central la inflamación (1).

Este proceso de la cicatrización de heridas es parte de la biología continua entre el estado patológico producido y la regulación de la diferenciación celular y los factores de crecimiento que regulan el desarrollo y formación del tejido nuevo.

En el Centro de Histoterapia Placentaria se evalúa un nuevo medicamento: la Jalea Cicatrizante de ácido hialurónico al 4 %. Este producto contiene glucosaminoglicanos rico en (AH) obtenido del procesamiento de los cordones umbilicales separados de las placentas humanas recolectadas a término en los hospitales Ginecobstétricos del país según el Programa Nacional de Recogida (2).

El AH pertenece al grupo del tipo glucosaminoglicanos, se sintetiza en la membrana del fibroblasto, célula de músculo liso vascular, células epiteliales, células endoteliales, se encuentra distribuido en los espacios extracelulares de todo el cuerpo especialmente formando parte del tejido conectivo (3-4).

Este sustancia tiene un amplio espectro terapéutico en la medicina, en ramas como oftalmología, ortopedia, etc. Existen preparaciones que tienen como principio activo el AH cuya finalidad es ejercer una acción cicatrizante, se utiliza en el tratamiento de procesos reparadores tisulares de curso clínicamente tórpido, en la evolución de úlceras varicosas, pustulares, tróficas, diabéticas; en cicatrices quirúrgicas de evolución tórpida y en quemaduras (5).

Al ser la piel una barrera de defensa para cualquier daño externo del organismo, la presencia del AH como uno de sus componentes posee un papel fundamental en la reparación de cualquier herida o lesión, ya que debido a las propiedades que el mismo posee trata de mantener la integridad del tejido fibroconectivo.

Su mecanismo de acción es a nivel celular e interviene en la migración, proliferación y diferenciación celular, por lo que, en los bordes del epitelio no dañado de una lesión, se produce una estimulación en la migración epitelial, regulando la relación que debe existir entre el epitelio, y los bordes de una herida y la interacción con la matriz extracelular (6).

El presente trabajo tiene como objetivo valorar las propiedades aceleradoras al proceso de cicatrización con una sal sódica de AH en forma de Jalea al 4% en heridas abiertas en piel de ratas.

Se utilizaron de forma aleatoria 20 ratas hembras adultas Sprague Dawley procedentes del CENPALAP. Las mismas se sometieron a un periodo de adaptación de 7 días en jaulas individuales con agua y alimentación ad libitum y bajo condiciones controlada de temperatura (24ºC ± 2), de humedad relativa (50-65 %), y con un fotoperiodo de 12h/12h ciclo de luz / oscuridad.

Diseño experimental y tratamientos

El peso inicial de las ratas fue de 200 a 250g. Se anestesiaron con pentobarbital sódico 40mg/Kg de peso corporal, depilándose la región dorso-escapular con una crema depilatoria, y se provocaron en condiciones asépticas cuatro heridas por animal, con un biótomo cutáneo de 9 mm de diámetro,7 eliminándose el tejido celular subcutáneo con una tijera. Inmediatamente después de practicada la herida (P ó ponches) se comenzó la aplicación de los tratamientos empleados, los que fueron:
P1- Jalea al 4 % de AH, P2- Control de evolución espontánea sin tratamiento,
P3– Placebo (Jalea base sin principio activo que posee carboximetilcelulosa, preservos y agua) y P4- Sulfadiacina de Plata (como control positivo). Los cuatros tratamientos al cambiar de un animal a otro fueron rotados a favor de las manecillas del reloj. El número total de aplicaciones fue de 7 días, con un intervalo de 24 horas. Posteriormente se sacrificaron los animales por el método de tracción de las vértebras cervicales. Diariamente se controló el estado clínico de los animales así como posible infección de las heridas.

Procesamiento y evaluación histopatológica

A 10 de los animales se les tomó muestra de las heridas para el estudio histopatológico, realizando la fijación de la misma en formol neutro buffer al 10 % por 24 h procesándose por la técnica clásica de inclusión en Parafina, las muestras se cortaron a 5 micras de espesor, coloreándose con hematoxilina-eosína y la coloración especial tricrómíca de Masson. Las observaciones histopatológicas se realizaron por microscopía óptica a doble ciego, a través de un microscopio Axiophot, donde se evaluó la migración epitelial y la reconstitución dérmica. Los aspectos considerados para la clasificación para ambos indicadores se reflejan en las tablas 1 y 2 (7).

Tabla 1: Criterios considerados para la clasificación de la evolución de la migración epitelial en la cicatrización de heridas abiertas en ratas.
Grados.	Migración epitelial	Bordes de la herida.	Costra	Herida.
Grado I	M. incompleta	Los bordes no han contactado	Hay abundante costra	H.abierta.
Grado II	M. intermedia.	Los bordes contactaron pero con un epitelio muy fino.	Puede o no haber costra.	H.cerrada
Grado III	M. completa.	Los bordes contactaron con un epitelio grueso.	No hay costra.	H.cerrada.

Tabla 2: Aspectos considerados para la clasificación de la reconstitución dérmica
Grado I	Predomina el tejido de granulación inmaduro, con incipiente formación de fibras colágenas distribuidas en la base de la herida, sin alinearse ni organizarse en forma de malla, pobre neovascularización. Severo infiltrado inflamatorio a células mononucleares.
Grado II	Imagen de reconstitución general de la matriz extracelular con tejido de granulación maduro y organizado, existen fibras colágenas depositadas con alguna alineación horizontal. Presencia de algunos vasos sanguíneos.
Grado III	Completa restitución de la matriz extracelular, con fibras colágenas maduras y organizadas horizontalmente en la neodermis. Algunos vasos pueden estar presentes, o pueden encontrarse colapsados por la compresión de las fibras colágenas circundantes.

Procesamiento y evaluación de la planimetría

A 9 de los animales se les tomó muestra de cada herida después de separada la dermis de la epidermis para un estudio morfométrico de planimetría. Para esto se separó dermis de epidermis colocando las muestras en una solución de bromuro de sodio al 5M a 37'C por 24 horas. Se colocó la epidermis en una hoja de papel y cada muestra fue escaneada en un equipo HEWLETT PACKARD SCANJET IIP. Las imágenes escaneada se procesaron usando un sistema de tratamiento de imágenes DIGIPAT elaborado por Eicisoft acoplado a un microscopio Axiophot, por donde, se determinó la circularidad, el perímetro de la herida y el área no epitelizada. Posteriormente fue realizado el siguiente cálculo para determinar el Area re-epitelizada (considerando como área inicial (AI) de herida 63.58 mm²) y el Crecimiento inicial se determinó dividiendo el área epitelizada de cada herida entre la media del perímetro del grupo.

Procesamiento estadístico

A estos valores se les aplicó un Análisis de Varianza de clasificación simple para un nivel de significación (P<0,05) y posteriormente el Test de Rango Múltiple según el STARGRAFIC sobre Windows.

En las observaciones clínicas diarias no hubo alteración en el comportamiento de los animales, ni se evidenció complicaciones en las heridas por la presencia de infección secundaria teniendo una evolución satisfactoria el ensayo.

Resultados histopatológicos

Estos resultados mostraron que el tratamiento correspondiente a la Jalea de AH al 4 % obtuvo la mejor respuesta en el análisis de la migración epitelial con un 70 % de heridas cerradas, al considerar la suma de la migración en Grado II y Grado III, de las mismas un 10 % ya poseían un epitelio grueso no observándose en los otros tratamientos, el otro 60 % había contactado los bordes considerándose herida cerrada, pero el epitelio era delgado. El tratamiento que le siguió en orden de respuesta positiva fue el placebo con un 40 % de herida cerrada en Grado II, aunque el epitelio era fino o delgado aún, le sigue el tratamiento control con un 37.5 % con una respuesta prácticamente similar, seguido por último de la sulfadiacina de plata con un 25 % todos en Grado II. Como se evidencia el peor comportamiento fue para éste tratamiento de sulfadiacina de plata con un 75 % de herida abierta en Grado I seguido de igual forma por el control con un 62,5 % en Grado I también ( Tabla 3 ).

Tabla 3: Influencia del ácido hialurónico en la migración epitelial y reconstitución dérmica en heridas abiertas en ratas Sprague Dawley
Tratamiento	Migración epitelial			Reconstitución dérmica en %
	Grado I. H. abierta	Grado II H. cerrada Epi. Fino	Grado III H. cerrada Epi. Grueso	Grado I	Grado II	Grado III
Control	62.5	37.5	0.0	50.0	50.0	0.0
Placebo	60.0	40.0	0.0	60.0	40.0	0.0
Sulfadiacina	75.0	25.0	0.0	62.5	37.5	12.5
Jalea al 4 % de AH	30.0	60.0	10.0	30.0	50.0	20.0

Desde el punto de vista histopatológico se refleja, como el tratamiento de la Jalea al 4 % de AH, fue el de menor porcentaje en Grado I de reconstitución dérmica con un 30 %, y solamente poseía una incipiente formación de fibras colágenas sin organizarse, predominando el tejido de granulación. Sin embargo en este grado se encontraban el de mayor porcentaje de la respuesta correspondiente a los otros tratamientos siendo para la sulfadiacina un 62.5 %, placebo con un 60 % y el control con un 50 %.

En el grado II de reconstitución dérmica se comportó con 50 % el control y la jalea al 4 % de AH con la presencia de una imagen general de reconstitución de toda la matriz extracelular conteniendo fibras colágenas depositadas con alguna alineación, y presencia de tejido de granulación.

La jalea de AH obtuvo un 20 % en grado III de reconstitución dérmica lo que demuestra que fue el tratamiento con mejor comportamiento en cuanto a la madurez de la matriz extracelular por encontrarse la misma con una completa restitución, mostrando una dermis bien formada con fibras colágenas maduras y organizadas horizontalmente

En la Fig_1 se observa como contactaron los bordes de la herida y hubo una reepitelización completa, el epitelio es grueso, así como existe una completa restitución de la matriz extracelular, con fibras colágenas organizadas horizontalmente.

El control en la Fig_2 y el placebo se comportaron de manera similar. A pesar de que el tratamiento de la sulfadiacina de plata posee un 12,5 % de respuesta en Grado III como valoración general, fue el que peor comportamiento reflejó para ambos indicadores evaluados.

En esta última figura se puede apreciar como los bordes epiteliales no han contactado, por lo tanto la herida esta abierta, hay presencia tejido de granulación.

Resultados de las evaluaciones de la planimetría.


La tabla 4 se refleja como la jalea al 4% de AH mostró el mejor valor del crecimiento lineal el que fue de 5.5 mm lo que refleja una mejor linealidad de los bordes del epitelio de la herida y un menor perímetro con 10.32 mm y menor circularidad con 61.33 respecto a los demás tratamientos existiendo diferencias estadísticas a favor de la Jalea al 4% de AH, lo que evidencia que todos los indicadores evolucionaron favorablemente hacia la reparación de la herida, demostrándose al obtener un área re-epitelizada de 56.80 mm2 para un 89.33%.

Tabla 4: Efecto del Acido Hialurónico en la cicatrización de heridas abiertas. Resultados de la Planimetría en la piel tratada de ratas.
		ARE ± E.S
Tratamientos	P±E.S	Mm2	%	CL±E.S	C± E.S
Control	21.07± 2.06 a	42.91± 2.60 a	67.48 a	2.03± 0.14 a	78.11± 4.67 a
Placebo	18.26± 2.06 a	43.02± 2.60 a	67.66 a	2.34± 0.14 a	76.33± 6.36 a
Sulfadiacina	22.78± 2.19 a	37.70± 2.75 a	59.29 a	1.65± 0.15 ab	75.87± 6.08 a
Jalea 4 %AH	10.32± 2.06* b	56.80± 2.60 *b	89.33 *b	5.5± 0.14 *c	61.33± 23.7 b
*p< 0.05 , a / b/ c p< 0.05 Se muestran valores de medias con el error estándar de cada uno de los parámetros que se determinaron en cada ponche. Perímetro (P en mm), Area Re-epitelizada (A.RE en mm2), Crecimiento Lineal (C.L en mm) y Circularidad (C en unidades arbitrarias). a,b,c difieren significativamente para (p<0.05) Test de Rangos Múltiples.

El resto de los tratamientos no tuvieron diferencias significativas entre ellos, no obstante al valorar los resultados del tratamiento de la sulfadiacina de plata, se observa una menor área re-epitelizada y un menor crecimiento lineal respecto a los demás tratamientos, a pesar de no mostrar diferencias significativas estadísticas, con el resto de los valores correspondientes al control y placebo.

Los resultados mostrados en la tabla 3 se deben posiblemente a que el AH como señalaron (8-10) basa su mecanismo de acción a nivel celular e interviene en la migración, proliferación y diferenciación celular uniéndose a una molécula de fibronectina, produciendo una estimulación de la migración epitelial, en los bordes del epitelio no dañado por una lesión, y de esta misma forma, regula la relación que debe existir entre el epitelio de los bordes de una herida, y la interacción con la matriz extracelular. Es por eso que se considera al AH como uno de los factores que regulan la cicatrización epitelial (11-13), así como participa en la diferenciación celular de los queratinocitos durante la reepitelización (14).

La respuesta histopatológica alcanzada en el tratamiento de Jalea al 4 % de AH en cuanto a la maduración de la matriz extracelular se debe a que en el proceso de cicatrización de heridas, lo que primero contacta son los bordes de la epidermis cerrando la herida, ocurriendo así la reepitelización como respuesta para restaurar las propiedades de barrera de la piel, pero el proceso de madurez de la dermis es más lento y puede demorar hasta incluso un año en restablecer las características histológicas definitiva de ser una masa de colágeno acelular, pálida, sin resistencia mecánica (1) (15-18).

También al ser el AH un componente mayoritario de la matriz extracelular y posee la capacidad de absorber grandes cantidades de agua en el espacio intercelular logra mantener las células unidas en una matriz gelatinosa, (11,19) Por otro lado, por ser un elemento producido por los fibroblastos, al aplicarse exógenamente, acelera o potencializa el proceso de formación de matriz extracelular, y del proceso de formación de las fibras elásticas, donde juega un importante papel, contribuyendo así a la síntesis del colágeno. El papel que juega el AH en la angiogénesis, morfogénesis, remodelación del tejido y el mantenimiento de la arquitectura del mismo lo han reportado diferentes autores (1,13), (20-21).

Los resultados de la planimetría coinciden con los de las evaluaciones histopatológicas, manifestando una correspondencia proporcional para ambos estudios en el tratamiento de la Jalea de AH al 4 %, al observar una respuesta reparadora, en el proceso de cicatrización de heridas abiertas por ponches superior al resto de los tratamientos, coincidiendo con los resultados informados en otros ensayos realizados por este diseño de experimento en nuestro país (22).

La relación existente entre el producto Hebermin EGF, y el AH, se expone en un modelo experimental in vivo mostrando que el EGF , estimula la síntesis de hialurónico en los queratinocitos de la rata, observándose una elongación y migración de estas células, y un incremento del AH en las vesículas perinucleales de las mismas. Resultados similares se encontraron en estudios in vitro de cicatrización de herida (23).

Los resultados obtenidos experimentalmente en este estudio coinciden con las consideraciones hechas por la literatura (24), donde se presentan resultados de cicatrización completa de heridas, empleando como uno de sus tratamientos membranas que contenían AH esterificado estéril. A su vez se refiere por la literatura que la participación activa del AH en la cicatrización de heridas, se debe a que existen receptores potenciales en la epidermis para el mismo (24-26) por otro lado, se ha reportado (26), que al emplearlo en forma de Gel, (forma farmacéutica similar al evaluado en este trabajo), en heridas bilaterales de la mucosa del oído medio, obtuvieron una cicatrización completa con una recuperación auditiva, muy superior a otros tratamientos usados sin AH.

De acuerdo con los resultados logrados en este trabajo, y los informados por la literatura, se considera que el AH posee propiedades aceleradoras al proceso de cicatrización, coincidiendo con lo citado por la literatura (27) quienes en post-operaciones obtuvieron una significativa aceleración del tejido de granulación, así como su sustitución por fibras colágenas bien alineadas en los inicios y una angiogénesis acelerada, todo el efecto expuesto se demostró al aumentar los niveles plasmáticos de AH después de quemaduras térmicas (28), con el objetivo de participar en el proceso de reparación del daño tisular, y una que se produce una mejoría considerable comienzan a disminuir estas concentraciones plasmáticas. Por lo que se demostró que este proceso se acelera si el AH es suministrado exógenamente ya que se describe que la aplicación tópica de este producto modula exógenamente los niveles en piel de AH como un biopolínero de muy disímil uso terapéutico, debido a su versatilidad y ubicuidad, lo que hace que no intervenga en un solo evento en el proceso de la cicatrización, sino que interviene en numerosos eventos, en que está involucrada la cascada de la cicatrización epidérmica o tisular(30-31).

Por todo lo expuesto anteriormente se puede concluir que la Jalea al 4 % de !!AH!!!Acido Hialurónico">AH tiene propiedades aceleradoras al proceso de cicatrización y que se comprueba que la sulfadiacina de plata brinda una protección antimicrobiana pero no ejerce acción cicatrizante.

1. Davidson J, Benm S. Regulation of angiogenesis and wound repair. Interactive role of the matrix and growth factors. Cellular and Molecular Pathogenesis. Edited by A. E. Sirica.Cap. 5. 79, 1996.
2. La Placenta Humana como materia prima farmacéutica. Resolución 2/2002. 2002
3. Papakonstantinov E, Karakiusalakis G, Karakiusalakis G, Roth M, Block L. Platelet-derive growth factor stimuilares the secretion of HA by prolioferating human vascular smooth cells. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 1995.
4. Bertheim V,Helltrom S. The distribution of hyaluronan in human skin and mature hypertrophic and keloid scrs. British J. Plast. Surgery., 47, 483, 1994.
5. Intercon. Indice de especialidades farmacéuticas. Editores médicos SA, 816, 1991.
6. Nakamura M, Nishida T. Recent developments in the use of hyaluronan in wound healing. Expert Opinion on Investigational Drugs., 4, 175, 1995.
7. Oruña L. Efecto del Ácido Hialurónico en la cicatrización de heridas abiertas en la piel de ratas. Trabajo de Diploma de Master en Anatomía Patológica Experimental, 2001.
8. Muir H, Hardigan L. Structure of proteoglicans, in biochemistry series one. Biochemistry of carbohidrates, London Butterworths., 153, 1975
9. Sherman L, Sleeman J, Herrlich P, Ponta H. Hyaluronate receptors: Key players in growth, differencition, migration and tumor progression. Curr Opin Cell Biol., 6, 726, 1994
10. Alam C, Seed M, Willougby D. Angiostasis and vascular regression in chronic granulomatous inflamation induced by Diclofenac in combination with hyaluronan in mice. J. Pharm. Pharmacol. 47, 407, 1995.
11. Nagorski C, Opalensky D, Bettelheim F. A study of collagen-hyaluronan interaction through swelling in polyacrylamide gels. Res. Commun Mol Pathol. Pharmacol 89, 179, 1995.
12. Papakonstantinou E, Karakiulakis G, Roth M, Block L. Platelet-derive growth factor stimulates the secretion of HA by proliferating human vascular smooth muscle cells. Proc. Natl. Acad Sci USA., 92, 9881. 1995.
13. Ponting J, Kumar S. Isolation and characterization of hyaluronan binding protein hyaluronectin, from human placenta and its colocalisation with hyaluronan. J. Anat., 186, 131. 1995.
14. Onarheim H, Brofeldt B, Gunther R. Markedly increased lymphatic removal of hyaluronan from skin after mayor thermal injury. Burns., 22, 212 , 1996.
15. Braverson J, Sorgente C. Chemotactic reponse of vascular endothelial cells to fibronectin. J. Cell Biol., 87, 64 A. 1980
16. Torres R. Cicatrización y cuidado de las heridas. Tratado de Cirugía. 1ra de México: Nueva edt interam S A de México. 1986.
17. Steed D. The role of growth factors in wound healing. Surgical clinics of Northamerica., 77, 243. 1997.
18. Alaish S, Yager D, Diegelmann R, Cohen I. The Biology of fetal wound healing: hyaluronate receptor expression in fetal fibroblasts. J. Pediatri Surg., 29, 1040. 1994.
19. Yokobori A. Mechanical test method on the estimation of the lubricant performance by hyaluronic acid. Biomed Mater Eng., 5, 117. 1995.
20. Wiig M, Abrahamsson S, Lundborg G. Effects of hyaluronan on cell proliferation and collagen synthesis: A study of rabbit flexor tendons in vitro. J. Hand Surg. AM., 21, 599, 1996.
21. Gan L, Fagerthoolm P. Leukocytes in the early events of corneal neovascularization. Cornea., 20, 96. 2001.
22. Berlanga J, Lodos J, Laabarta V, Merino N, González T, Hayes O, Puente P, Mulry J, López-Saura P. The effect of the epidermal growth factor treatment schedule on the healing of fullthickness wounds in pigs. Biotecnología aplicada., 14, 227, 1997.
23. Pienimaki J, Rilla K, Fulop C, Sironen R, Karvinen S, Pasonen S, Lammi M, Tammi R, Hascall V, Tammi M. Epidermal growth factor activates hyaluronan synthase 2 in epidermal keratinocytes and increases pericellular and intracellular hyaluronan. J. Biol. Chem., 276, 20428. 2001.
24. Takeshita F, Ayukawa Y, Iyama S, Svetsugu T, Oishi M. Histological comparison of early wound healing following dense hydroxyapatite granule grafting and barrier placement in surgically-created bone defects neighboring implants. J. Periodontol., 68, 924. 1997
25. Mc Carty M. Glucosamine for wound healing. Med. Hypotheses., 47, 273. 1996.
26. Li G, Feghali J, Dinces E, McElveen J, Van de Water T. Evaluation of esterified hyaluronic acid as middle ear-packing material. Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 127, 534. 2001.
27. Murashita T, Nakayama Y, Hirano T, Ohashi S. Acceleration of granulation tissue in growth by hyaluronic acid in artificial skin. Br. J. Plast Surg., 49, 58. 1996
28. Tajime S. Fibrous long spacing fiber formation by collagen and non collagenous acidic components from calf skin. J. Dermatol. Sci., 12, 104. 1996.
29. Laugier J, Shuster S, Rosdy M, Csoka A, Stern R. and Maibach H. Topical hyaluronidase decreases hyaluronic acid and CD44 in human skin and in reconstituted human epidermis: evidence that hyaluronidase can permeate the stratum corneum. Br. J. Dermatol., 142, 226. 2000
30. Tan S, Johns M, Greenfield P. Hyaluronic acid- A versatile biopolymer. Aust J. Biothechnol., 4, 38. 1990.
31. Wollina U, Konrad H, Fischer T. Recessive epidermolysis bullosa dystrophicans (Hallopeau-Siemens) improvement of wound healing by autologous epidermal grafts on an esterified hyaluronic acid membrane. J. Dermatol., 28, 217. 2001.