Cuba

Introducción
la ingestión de etanol resulta un problema médico y social que se ha incrementado, en los últimos años en niños y adolescentes, etapa de la vida que resulta interesante y necesaria estudiar ya que la respuesta del organismo es diferente. El hígado se considera el órgano central de defensa bioquímica y xenobiótica,participando en la eliminación de tóxicos xonobióticos como el etanol. Se plantea heterogeneidad zonal funcional y metabólica con relación a las células hepáticas en las tres zonas labulillo hepático:periportal, intermedia y perivenosa. Se señalan diferencias estructurales en el número y citoplasma,así como en la distribución del glucógeno en los hepatocitos de las diferentes zonas. Por eso nos propusimos comprobarla existencia de heterogeneidad zonal en el lobulillo hepático en ratas alcohólicas y
controles, identificando las alteraciones morfológicas y ultramicroscópicas que el alcohólismo crónico provoca en los hepatocitos de las tres zonas.
Métodos
Para el estudio morfológico (M.O) se tomaron muestras de hígado de 20 ratas albinas de ambos sexos ( 10 de cada sexo), divididas en 2 grupos tratadas y controles y para el estudio de las estructuras y subcelulares se
seleccionarán fragmentos hepáticos de 3 animales de cada grupo (2 hembras y un macho. El glucógeno se determinó por la técnica de PAS. a las ratas tratadas se les suministró 6 gramos de etanol dilvido en agua por Kg de peso corporal, por
vía oral desde los 28 días de nacida hasta los 90 días.
Resultados
Al microscopio óptico los heátocitos de ratas alcohólicas mostraron esteatosis intensa, focos de células con signos de muerte por mecrosis, acompañados
de inflamación focal con abundantes polimorfonucleares fundamentalmente en la zona periportal, cuerpo de Mallory en la zona perivenosa. Al microscopio
electrónico los hepatocitos de las ratas tratadas presentaron núcleos más heterocromáticos, mitocondrias más electrondensas, disminución de glucógeno y
retículo endoplasmático liso más extenso y con luz más dilatada que las de las ratas controles. La reación de PAS resultó inferior en ratas alcohólicas.

En la actualidad el alcoholismo constituye la más relevante toxicomanía a nivel mundial, por ser la más universal y por las complicaciones médico- sociales que produce y el más pronóstico de esta enfermedad, una vez establecida. El consumo excesivo y prolongado de etanol predisponen al individuo a padecer otras alteraciones como por ejemplo enfermedades hepáticas (1,2), gastrointestinales (3), daño en los sistemas nervioso e inmune (4), hipertensión arterial y aterosclerosis (5), así como alteraciones en el comportamiento social del individuo (6).

En las últimas décadas se ha comprobado que la ingestión de bebidas alcohólicas se ha ido incrementando de forma alarmante e indiscriminada alcanzando el 70% de la población de 16 años o más (7-8). En el primer mundo consumen etanol en alguna cantidad el 50% de los adolescentes de entre 12 y 17 años. En Estados Unidos la cifra de alcohólicos oscila entre 15 a 20 millones, (9) en América Latina fluctúa entre 4 y 24% de la población de 16 o más años y en Cuba consumen bebidas alcohólicas el 45,2% de los sujetos mayores de 15
años (10).

Durante la adolescencia se producen cambios dramáticos en el organismo debido a
variaciones en los niveles hormonales, como una consecuencia de la puesta en marcha de la pubertad (11,12) . En la rata la adolescencia se define como la fase peripubertal de maduración sexual que comienza alrededor de los 28 días y culmina a los 50 días en la hembra y a los 63 días en el macho (13,14). Durante esta etapa, el comportamiento y respuesta farmacológica de los animales difiere de aquellos más jóvenes o más viejos (14).

El hígado es una glándula voluminosa que realiza importantes funciones, es el órgano diana del alcoholismo y se considera el centro del metabolismo y de la defensa xenobiótica, es uno de los órganos más afectados por el abuso en la ingestión de etanol (2). Se plantea que la enfermedad hepática alcohólica se desarrolla en tres etapas o estadios: esteatosis hepática, hepatitis tóxica o alcohólica y cirrosis hepática (15). En cada etapa se describen lesiones anatomopatológicas diferentes. En la etapa de esteatosis se observa infiltración grasa de los hepatocitos. En la hepatitis alcohólica se añaden
otras lesiones, como son: infiltrados leucocitarios, cuerpos de Mallory y necrosis celular. La cirrosis se caracteriza por la presencia de extensas áreas de fibrosis y desorganización de la arquitectura lobulillar (15).

Se plantea heterogeneidad zonal a nivel del lobulillo hepático, describiéndose tres regiones en el mismo: periportal, intermedia y perivenosa, las células de dichas zonas defieren en su comportamiento metabólico, contenido de sus enzimas e incluso en sus estructuras subcelulares (16-18).

No se reportan trabajos donde se estudien las alteraciones que provoca el alcohol sobre las diferentes zonas del lobulillo hepático de ratas adolescentes, por lo que resulta interesante analizar las características morfológicas y ultramicroscópicas del hígado en las tres zonas del lobulillo hepático, de ratas que ingieren éste tóxico desde el comienzo de la adolescencia.

Se utilizaron 20 ratas albinas, machos de 28 días de vida postnatal, seleccionados mediante una tabla de números aleatorios; se conformaron dos grupos: experimental (grupo A) y control (grupo B).

A las ratas del grupo A se les suministró etanol al 40% diluido en agua, desde los 28 hasta los 90 días de nacidas, a razón de 6 gramos por kilogramo de peso corporal, dividido en dos dosis con un intervalo de 4 horas entre una y otra; la vía de elección fue la oral, y se utilizó una cánula intraesofágica, según Tsukamoto (19). A las ratas del grupo B se les suministró agua en la misma cantidad, a las mismas horas y mediante el mismo procedimiento que a las ratas experimentales. Las ratas se colocaron en jaulas individuales y se les suministró agua y comida para ratas ad libitum, manteniéndose en
iguales condiciones ambientales e higiénicas.

Al final de la experiencia los animales fueron colocados en atmósfera de éter con el auxilio de una campana, con esta maniobra el animal muere y se procedió a la toma de fragmentos de hígado de un centímetro cúbico, los cuales se fijaron en líquido de carnoy y formalina neutra tamponada al 12 % y el material obtenido fue procesado por el método de la parafina. Se obtuvieron cortes histológicos a cuatro micras.

Para realizar el estudio histológico se tomaron 10 cortes de cada animal y se colorearon con la técnica de Hematoxilina y Eosina.

La esteatosis se evaluó mediante la presencia de vesículas (macro y microvesículas) en el citoplasma de los hepatocitos. Se tomó la siguiente escala convencional: Negativo (0). ninguna célula afectada, Débil (x)....células afectadas aisladas, Moderada (xx)... la
mitad de las células afectadas, Intensa (xxx)....la totalidad o casi la totalidad de las células afectadas.

La inflamación se valoró de acuerdo a la presencia de células inflamatorias en el tejido hepático. Se evaluó de la siguiente forma: Ausente (0).... no hubo células inflamatorias, Escasa (x).....células inflamatorias aisladas, Focal (xx)...colección de células inflamatorias en el parénquima, Inflamación difusa (xxx).... áreas extensas de células inflamatorias en el parénquima y en los tractos portales.

La fibrosis se evaluó por la presencia de tejido conectivo. Los cuerpos de Mallory se reconocieron como estructuras redondeadas intensamente acidófilas en el citoplasma celular. Las megalomitocondrias se identificaron por la existencia de reacción acidófila rodeando a los núcleos.

Para el estudio del glucógeno hepático se tomaron 10 cortes de cada animal. Se utilizó la técnica de PAS según Hotchkiss (20). Como control se tomaron dos de los 10 cortes y se incubaron con amilasa salival a 37 grados centígrados, en la estufa, durante tres horas, antes de realizar la técnica de PAS. Se utilizó la siguiente escala convencional: Negativo (0).....no hay reacción, Débil (x)....hasta 10 gránulos PAS + por célula, Intensa (xx).... más de 10 gránulos PAS + por célula.

Todos los cortes fueron observados y fotografiados en un microscopio Olympus.

Para el estudio de las estructuras subcelulares se seleccionaron fragmentos de hígados de cinco animales de cada grupo escogidos al azar, los cuales se fijaron en glutaraldehido al 2,5% en buffer fosfato y se postfijaron en tetraóxido de osmio al 1%. Después se deshidrataron en alcoholes crecientes y se pasaron por óxido de propileno. Finalmente se incluyeron en araldita.

Se obtuvieron cortes de 50 nm con un ultramicrótomo LKB IV, utilizando cuchillas de vidrio. Los cortes se colorearon con azul de toluidina y se contrastaron con citrato de plomo y acetato de uranilo. Se observaron en el microscopio electrónico de transmisión HITACHI H-7000 del hospital Hermanos Ameijeiras, donde se obtuvieron fotomicrografías representativas de cada caso.

Estudio histológico

Los hígados de las ratas alcohólicas, presentaron esteatosis moderada en los hepatocitos de las zonas periportal, intermedia y perivenosa, en tanto que en las ratas controles no se observó esteatosis.

Los hígados de las ratas alcohólicas presentaron pequeños focos de células con signos de muerte por necrosis, acompañados de inflamación focal, con abundantes polimorfonucleares y células de la serie monocito/macrófago; esta imagen histológica se observó en las tres zonas del lobulillo hepático, pero fueron mas frecuentes en la zona periportal.
Algunos hepatocitos mostraron una marcada disminución de la talla celular y presentaron núcleos muy heterocromáticos y deformados. La cromatina se dispuso en masas junto a la envoltura nuclear, adoptando la forma de media luna o de herradura; células con estas características son más frecuentes en la zona perivenosa.

No se observaron signos de fibrosis en los hígados de las ratas alcohólicas.

Se observaron megalomitocondrias en los hepatocitos de las tres zonas en los hígados de las ratas alcohólicas.

Los cuerpos de Mallory estuvieron presentes en algunos hepatocitos de los hígados de las ratas alcohólicas, pero éstos no fueron abundantes, apareciendo sólo en las zonas perivenosas.

Los hepatocitos de las ratas controles mostraron un aspecto normal. Los núcleos fueron grandes, únicos y eucromáticos y el citoplasma presentó basofilia marcada. No se observaron células necróticas en ninguna de las tres zonas del lobulillo portal; tampoco se observaron neutrófilos ni otras células inflamatorias. Algunos hepatocitos de la zona perivenosa aparecieron con una marcada disminución del tamaño celular y presentaron núcleos muy heterocromáticos, deformados y pequeños.

No se observaron cuerpos de Mallory ni megalomitocondrias en ninguna de las tres zonas, en las ratas controles.

Histoquímica del glucógeno
En los hígados de las ratas alcohólicas, la reacción de PAS fue muy inferior a la presentada por las ratas controles (Fig.1). En la zona perivenosa, la reacción fue débil o no se observó (Fig.2); las células de la zona intermedia, presentaron reacción débil en general y algunas células aisladas presentaron reacción intensa. Las células de la zona periportal, también presentaron reacción débil, con un mayor número de células con reacción intensa.

En los hígados de las ratas controles la reacción de PAS fue superior a la mostrada por las ratas alcohólicas, los hepatocitos de la zona periportal presentaron reacción intensa (Fig.3). En la zona intermedia, la mayoría de las células, presentaron reacción intensa, pero se vieron muchas células con reacción débil. Las células de la zona perivenosa, presentaron débil reacción.

Estudio ultraestructural

Los hepatocitos de las ratas alcohólicas presentaron núcleos mucho más heterocromáticos que los de la ratas controles. El retículo endoplasmático rugoso se observó abundante y formando haces de cisternas largas, dilatadas y en hileras paralelas, las cuales se apreciaron separadas unas de otras (Fig. 4). El retículo endoplasmático liso se observó también extenso y con una luz dilatada. Las mitocondrias presentaron forma ovalada, muy bundantes y más electrón densas que las ratas controles (Fig. 5). En los hepatocitos de
las ratas alcohólicas se observaron, además, numerosos lisosomas y gránulos de
lipofucsina en el polo biliar. El canalículo biliar apareció dilatado y cerrado por desmosomas. El glucógeno se vio muy disminuido y formando pequeños lagos entre los organitos citoplasmáticos.(Fig. 4). También se apreciaron depósitos de grasa en el citoplasma (Fig.5).

Los hepatocitos de las ratas controles presentaron núcleos eucromáticos con nucléolos precisos centrales y de configuración densa. El retículo endoplasmático formó cisternas paralelas, generalmente agrupadas, no se observaron dilataciones de la luz ni en el retículo rugoso ni en el retículo liso (Fig. 6). Las mitocondrias se apreciaron ovaladas y menos electrón densas que las encontradas en los hepatocitos de las ratas alcohólicas (Fig.6). En el polo biliar se observaron lisosomas con características normales, el
canalículo presentó una luz estrecha y cerrada por desmosomas. El glucógeno fue muy abundante y se observó formando extensos lagos entre los organitos citoplasmáticos (Fig. 7).

Las ratas que ingieren alcohol desde la adolescencia presentaron signos de daño severo del parénquima hepático Los signos que con más frecuencia se encontraron fueron: esteatosis moderada y necrosis focal con acúmulos de neutrófilos y otras células inflamatorias.

En la adolescencia el individuo es más susceptible al etanol que en etapas posteriores del desarrollo, lo que hace que la ingestión irresponsable de este tóxico, en esta etapa de la vida, devenga en un hábito mucho más peligroso, al menos para el hígado.

Según plantea la literatura, la esteatosis es un signo precoz de daño hepático y puede aparecer sola o presentarse con otras alteraciones anatomopatológicas más severas (21).

El hígado sano contiene lípidos en cantidades relativamente pequeñas y son los fosfolípidos los más abundantes (21,22). En el hígado graso la acumulación de lípidos es a expensas de los triacilglicéridos, cuya concentración en las células hepáticas puede elevarse de 10 a 50 veces sobre el nivel normal (21,23).También se ha observado un aumento en el colesterol esterificado, así como en los ácidos grasos libres (21-23).

Se ha planteado que la muerte celular por necrosis se produce ante un daño masivo que provoca el colapso de la homeostasis interna de la célula con pérdida de la síntesis de ATP, de la integridad de la membrana y de la expresión de los genes (2); en el presente trabajo la noxa que provocó este tipo de muerte celular es el alcohol.

La gran cantidad de neutrófilos y otras células de la inflamación encontradas en los sitios de necrosis focal se puede explicar pues el etanol induce al hepatocito dañado, a producir citoquinas que favorecen la quimotaxis del neutrófilo hacia los sitios de necrosis durante el proceso de la inflamación (24,25). También se ha planteado que el alcohol estimula la síntesis de un factor paracrino, la proteína Kc/gro, que también induce la extravasación del neutrófilo (25).

Las células necróticas y los focos de células inflamatorias aparecen indistintamente en las tres zonas del lobulillo hepático, pero fueron más numerosas en la zona periportal.

En la zona perivenosa del lobulillo hepático de ratas alcohólicas se encuentran
hepatocitos muy disminuidos de tamaño, contraídos, con núcleos heterocromáticos y algunos con marginación de la cromatina. Las características morfológicas de estas células se corresponden con las descritas por otros autores como células apoptóticas (26,27).

Se ha planteado que el etanol es capaz de desencadenar la muerte mediante suicidio celular por apoptosis en células dañadas (26). No se conoce la significación clínica de la apoptosis en la enfermedad hepática alcohólica, aunque su incidencia esta siendo objeto de estudio en los últimos años.

La presente investigación reveló que los hepatocitos de las ratas que ingieren alcohol desde la adolescencia poseen pocos cuerpos de Mallory y éstos están presentes en las células de la zona perivenosa, zona en la cual se encontraron células con signos de muerte por apoptosis. Otros autores señalan que dichos cuerpos no son tan frecuentes en el hígado de ratas alcohólicas (15).

Se ha postulado que los cuerpos de Mallory están relacionados con la degeneración de los filamentos intermedios de citoqueratinas (27) y es posible que en las células que presentan estas estructuras en su interior se desencadenen los mecanismos de suicidio celular por apoptosis constituyendo éste un proceso de defensa del parénquima hepático.
Este hecho debe ser corroborado por otros trabajos.

Algunos hepatocitos perivenosos de las ratas controles presentaron células con
características de muerte por apoptosis, aunque estas imágenes fueron menos frecuentes que en las ratas alcohólicas. Se ha propuesto que los hepatocitos tienen la capacidad de proliferar y renovar la masa del lobulillo hepático y que pueden desplazarse desde la periferia hasta alcanzar las inmediaciones de la vena centrolobulillar, donde las células envejecidas mueren por apoptosis (27); este proceso ha sido seguido mediante técnicas autorradiográficas (26).

Las células en apoptosis encontradas en el hígado de las ratas controles pueden ser hepatocitos en las etapas terminales del proceso de diferenciación.

Por otra parte en el estudio histoquímico del glucógeno se comprobó que este carbohidrato se encontró muy disminuido en las ratas alcohólicas, dato que fue comprobado mediante el estudio ultraestructural, estos resultados coinciden con los reportados por otros investigadores (28).

La distribución del glucógeno fue diferente en las tres zonas del lobulillo hepático y la respuesta al etanol varió en las diferentes zonas.

El estudio de las estructuras subcelulares de los hepatocitos de las ratas alcohólicas corroboró los severos daños que la ingestión de etanol provocó en el hígado de ratas que ingieren alcohol desde la adolescencia; las alteraciones que se encontraron fueron similares a las reportadas por otros autores en ratas adultas (29); entre las estructuras más afectadas se encuentraron las mitocondrias, el retículo endoplasmático, los lisosomas y el núcleo, el cual fue más heterocromático.

El hepatocito posee tres vías principales para el metabolismo del etanol, cada una localizada en compartimentos subcelulares diferentes: La vía del alcohol deshidrogenasa (DA), enzima del citosol, el sistema de oxidación microsomal del etanol y la vía de la catalasa de los lisosomas (30). En la oxidación del etanol por la DA se producen NADH que son llevados a las mitocondrias para su reoxidación (30).

Las estructuras que participan directamente en el metabolismo del etanol resultaron las más afectadas por el alcoholismo crónico y el daño observado fue muy similar al reportado en ratas adultas que ingieren etanol por un tiempo prolongado (27); lo cual demuestra, una vez más, que el etanol ingerido en la etapa de la adolescencia resulta perjudicial para el hígado.

Las ratas alcohólicas presentaron variaciones en la respuesta al etanol en las tres zonas; así se comprobó que los focos de células necróticas e infiltrados leucocitarios aparecen con más frecuencia en la zona periportal; en tanto las células apoptóticas y los cuerpos de Mallory se observaron en la zona perivenosa. El glucógeno mostró una franca variabilidad en las tres zonas del lobulillo hepático, tanto en las ratas controles como en las tratadas.

Por otra parte se comprobó que el glucógeno en las ratas controles, se distribuyó de forma heterogénea en las tres zonas del lobulillo hepático, con mayor proporción en la zona periportal y menor en la perivenosa. La ratas alcohólicas presentaron menos glucógeno en las tres zonas manteniendo la heterogeneidad entre ellas.

Todo lo antes expuesto confirma que las tres zonas del lobulillo hepático difieren entre sí, como han planteado otros autores, aunque estas diferencias son más funcionales y metabólicas, que morfológicas.

1.. Santonastoso M; Zanatta N; Cioffi A; Garbelotto R; Cechetti E. Alcohol-related
liver disease in the age. Recenti Prog Med 2000; 91: 113-5.
2. Sherlock S. Alcoholic liver disease. Lancet 1995; 345: 227-229.

3. Lévy P. Alcool et pancréas. Pathol Biol 2001; 49: 753-8.

4. Jerrells T.R. and Pruett S.B.: Immunotoxic effects of ethanol in: Dean, J.H. y
otros. Inmunotoxicology and Inmunopharmacology Chapter 18: Second edition. New York Raven
Press Ltd ,1994. pp 323-347.

5. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Alcohol and coronary heart
disease. Alcohol Alert 1999; 45. Disponible en
URL:http://silk.n.h.n.gov/silk/niaal/publication/aa45.htm.

6. González MR. SOS, Alcohol y otras drogas. Santiago de Cuba: Editorial Oriente;
1998. p. 31-32.

7. España uno de los 8 países europeos donde se bebe más alcohol. Jano On-line y
agencias 13/09/2001 10:39. Disponible en URL:http://db.doymaes/cgi-

8. Paniagua RH, García SC, Castellano GB. Consumo de tabaco, alcohol y drogas no
legales entre adolescentes y relación con los hábitos de vida y el entorno. An Esp
Pediatr 2001; 55(2): 121-128.

9. Lieber CS. Medical disorders of alcoholism. N eng . J Med 1995; 333: 1056-62.

10. Chang M, Cañizares M, Sandoval JE, Bonet M, González R. Características del consumo
de bebidas alcohólicas en la población cubana. Rev del Hosp Psiq Hab 1998; 49(3): 257-63.

11. Windle M. Alcohol use and abuse: some finding from the National Adolescent Student
Health Survey. Alcohol Health and Res. World. 1990. 15: 5-10.

12. Witt ED. Mechanisms of Alcohol Abuse and Alcoholism in Adolescents: A case for
developing animal models. Behav. neural. biol. 1994. 62: 168-177.

13. Odell WD.Sexual maturation in the rat. In Grumbach, M.M.; P.C. Sizonenko; M.L.
Aubert: Control of the onset of puberty. Baltimore, M.D.: Williams and Wilkins,1990.
pp183-210.

1.. Simpon KI, Peters TJ. Animal models of alcoholic liver disease. Ballieres Clinical
Gastroenterology 1993; 7:609-25.
2.. Hall P. Pathology and pathogenesis of alcoholic liver disease. Hal, P.: Alcoholic
Liver Disease: Pathology Epidemiology and Clinical. New York. Edward Arnold, 1985. pp 41-
48
3.. .Jungerman K. Metabolic zonation of liver parenchyma: Significance for the
regulation of glycogen metabolism glyconeogenesis and glycolisis. Diabetes/Metabolism
1997. 3: 269-293.
4.. Jungerman k. Zonation of metabolism and gene expression in liver.
Histochemistry. 1995. 103: 81-91.
5.. Jungerman K.Zonal liver cell heterogeneity. Karger, S.; A.G. Baser. Enzyme 46
Switzerland Colombo Bern. 1992. pp. 5-7.
19. Tsukamoto H, French SW, Beaso NB. Severe and progressive steatosis and focal necrosis
in rat liver induced by continuos intragastric infusion of ethanol and low fat diet.
Hepatology. 1985, 5: 224-232.

20. Hotchkiss RD. A microchemical reaction resulting in the staining of polychacaride
structures in fixed tissue preparations. Arch. Biochem. 1948. 16:131.

21. Simson KJ. Pathogenesis of alcoholic hepatic steatosis. Add. Biol.1: 1996; 363-370.

22. Takeda Y, Arji S, Kaido T, Imamura M. The impairment of hepatocytes and sinusoidal
endothelial cells during cold preservation in rat fatty liver induced by alcohol and the
beneficial effect hepatocyte growth factor.Transp. Int 2003; 16(4): 241-9.

23. Colditz GA, Gioannuci E, Rimm EB. Alcohol intake in relation to diet and obesity in
women and men. Am. J. Clin. Nutr. 1997.61:49-55.

24. Ainsivorth, T.M, Lynam EB, Sklon LA. Neutrophil function in inflamation and infection
in: Sirica, A.E. Cellular and Molecular Pathogenesis. Philadelphia. Lippincott-Raven.
Publishers, 1996. pp 37-55.

25. Sozzani,S y otros. Chemokines: a superfamily of chemostatic cytokines. Int. J. Clin.
Lab. Res. 1996. 26: 69-82.

26. Majno, G, Joris J. Apoptosis, Oncosis and Necrosis. Ammer. J. Pathol. 1995; 146: 7-15.

27. Goldin RD y otros: Apoptosis liver disease: reversibility of ethanol induced
changes.j. Pathol.1993; 171: 73-76.

28. Farbizewski, R y otros: Branched-chain amino and enriched diet given simultaneously
with ethanol partially prevents morphological and biochemical changes in the liver. Pat.
Pol. 1990; 41:183-186.

29. French, SW y otros: Cytoskeleton. In Le Bouton, A.V. Molecular and cell. Biology of
the Liver. Boca Raton. CRC Press., 1993. pp 143-180.

30. Lieber, CS. Metabolism and metabolic. Effect of alcohol. Medical Clinics of North
America 1994; 68(1): 3-31.