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Introducción
La hipermetilación de promotores se ha revelado como uno de los mecanismos más frecuentes de inactivación de genes supresores tumorales, tanto en tumores sólidos como en leucemias y linfomas. En tumores de sistema nervioso, muchos trabajos encuentran pérdidas heterocigóticas y mutaciones en este tipo de genes; sin embargo, la importancia de los mecanismos epigenéticos de control de la expresión génica en el proceso tumoral ha sido muy poco estudiada.
Material y métodos
El estado de metilación de los promotores de los genes PTEN, RASSF1A, MGMT, p14/ARF y p16/INK4A se analizó mediante MSP en un total de 21 líneas celulares de tumores del sistema nervioso (12 neuroblastomas, 8 astrocitomas y 1 astrocitoma/oligodendroglioma). Asimismo, se estudió la expresión de estos genes mediante RT-PCR.
Resultados
Todas las líneas presentaron metilación en al menos un alelo de RASSF1A. MGMT también presentó metilación en 7 de las ocho líneas celulares de astrocitoma, pero en tan sólo una línea de neuroblastoma. Las líneas celulares GOS3 y MOG-G-CCM mostraron metilación en uno de los alelos de PTEN. Ni p14/ARF ni p16/INK4 presentaron metilación del promotor en ninguna de las líneas analizadas.
Tan sólo para RASSF1A hubo una correlación casi perfecta entre la metilación del promotor y la pérdida o reducción en la expresión, mientras que esta correlación no se dio en el resto de genes analizados.
Conclusión
La metilación de RASSF1A y MGMT es una alteración muy frecuente en líneas celulares de astrocitoma, siendo menos importante en los genes PTEN, p14 y p16. Asimismo, RASSF1A aparece hipermetilado en un 100% de líneas de neuroblastoma, lo cual a su vez se correlaciona con una pérdida en la expresión del gen. La pérdida de función del gen RASSF1A puede ser de gran importancia en la etiología de algunos de los principales tumores de sistema nervioso.

La metilación aberrante de citosinas es un mecanismo importante de disregulación en el proceso tumorigénico, al que puede contribuir de dos maneras, que en muchas ocasiones aparecen simultáneamente: hipometilación global del genoma (que puede llevar a inestabilidad cromosómica, reactivación de secuencias parasitarias y pérdida de la impronta genómica), e hipermetilación del promotor de ciertos genes supresores tumorales.
Tradicionalmente, se ha considerado como genes supresores tumorales a aquellos implicados en procesos de control del ciclo celular, la reparación o la apoptosis, cuya inactivación puede contribuir al proceso tumoral, favoreciéndose la proliferación celular, la supervivencia y la acumulación de alteraciones genéticas.
En astrocitomas, algunos de los genes supresores tumorales más importantes (TP53, PTEN, p16INK4A, RB1), han sido hallados frecuentemente inactivados por pérdidas alélicas acompañadas de mutaciones y pérdidas homocigóticas. Sin embargo, otros mecanismos de inactivación epigenéticos como la metilación de promotores han sido poco estudiados. El gen MGMT, cuya función es la reparación del genoma mediante la eliminación de grupos alquilo, se ha visto hipermetilado fundamentalmente en astrocitomas de bajo grado y glioblastomas secundarios (Nakamura et al., 2001), mientras que otros genes como CALCA y CDH-1 también presentan metilación en estos tumores (Uhlmann et al., 2003).
Mientras que PTEN aparece principalmente inactivado por mutación en tumores del sistema nervioso, la pérdida homocigótica es el mecanismo más frecuente de alteración en los genes p14ARF y p16INK4A. Sin embargo, la inactivación por hipermetilación del promotor ha sido poco estudiada para estos genes, que sí están frecuentemente metilados en otros tumores, como cáncer de próstata, pulmón y endometrio (en el caso de PTEN), y carcinoma oral escamoso, NSCLC, cáncer de mama, colon y vejiga (casos de p14 y p16) (Dominguez et al., 2003; Jarmalaite et al., 2003; Shintani et al., 2001). Otro gen que aparece muy frecuentemente metilado en varios tipos de neoplasia es RASSF1A (Dammann et al., 2001; Harada et al., 2002; Lee et al., 2001), el cual, sin embargo, ha sido hasta la fecha muy poco estudiado en tumores astrocíticos.
Objetivos
Se estudió el estado de metilación de los promotores de los genes RASSF1A, PTEN, MGMT, p14ARF y p16INK4A en 21 líneas celulares de tumores del sistema nervioso mediante la técnica MSP (Methylation-Specific PCR). Los resultados obtenidos tras este estudio fueron contrastados con la expresión de estos mismos genes, mediante un ensayo de RT-PCR.

Cultivo celular
Ocho líneas celulares de astrocitoma (T98G, LN405, U118 MG, U251 y U87 MG (grado IV), y SW1088, SW1783 y MOG-G-CCM (grado III)), 1 de astrocitoma/oligodendroglioma (GOS3) y 12 de neuroblastoma (SK-N-Be(2), SK-N-DZ, SK-N-FI, SK-N-MC, SK-N-SH, KELLY, IMR32, MC-IXC, MHH-NB-11, SH-SY5Y, SIMA y Be(2)C) fueron cultivadas en medio DMEM, suplementado con un 10% FBS, 4% aminoácidos no esenciales y 1% penicilina/estreptomicina. El DNA fue purificado mediante fenol-cloroformo y precipitado con etanol absoluto frío.
MSP
1 microg de DNA de cada línea celular fue modificado siguiendo el procedimiento descrito por Herman y cols. (Herman et al., 1996). Para realizar la MSP de cada gen, se añadieron volúmenes de 1,5-2,5 microl de DNA modificado a mezclas de reacción que contenían tampón de reacción a concentración final 1X, dNTPs 0,8 mM, MgCl2 1,5-2,5 mM, 5-10 pmol de cebadores y 1 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA), hasta un volumen final de 25 microl. Para las MSP de p14ARF y p16INK4A fue utilizada la enzima BioTaq (Bioline Ltd., London, UK), y las reacciones fueron realizadas en un volumen de 50 microl. Los cebadores utilizados para PTEN, p14 y p16 habían sido previamente descritos (Herman et al., 1996; Salvesen et al., 2001), y los utilizados para RASSF1A y MGMT fueron diseñados mediante el programa informático MethPrimer (Li and Dahiya, 2002). Las secuencias de estos cebadores fueron, para RASSF1A-U : 5’-TCACCCATTTTTCCATTTCTCT-3’ (sentido), y 5’-CTTTTTTTCCCTTTCTTCTCTT-3’ (antisentido); para RASSF1A-M: 5’-TTTTTCCATTTCGCGTCTCT-3’ (sentido) y 5’-CGTTTTTGCCCTTTCTTCGC-3’ (antisentido); para MGMT-U: 5’-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3’ (sentido), y 5’-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3’ (antisentido); y para MGMT-M: 5’-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3’ (sentido), y 5’-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3’ (antisentido).
Los programas utilizados para la PCR incluían los siguientes pasos: desnaturalización inicial, a 95ºC durante 10 minutos; 30-35 ciclos de amplificación, 94ºC 1 min, 58-65ºC, 45 s y 72ºC, 45 s; un paso final de extensión, a 72ºC, 10 min. Para las PCRs de p14/ARF y p16/INK4A se incluyó un paso de hot start a 80ºC, 10 min.
RT-PCR
El RNA de cada línea celular fue extraído con el reactivo TRIzol® (Invitrogen Ltd., Paisley, UK), siguiendo las instrucciones del fabricante. 5 microg de RNA fueron sometidos a retrotranscripción mediante la enzima SuperscriptII RNA retrotranscriptase (Invitrogen Ltd., Paisley, UK), también siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA resultante fue diluido a 1:5, y guardado a –20ºC hasta su posterior uso.
Las RT-PCRs para determinar la presencia de mRNA de los genes MGMT, RASSF1A, p14ARF, p16INK4A y TFR (receptor de transferrina, que fue utilizado como control interno), fueron realizadas usando las siguientes condiciones: 1,5 microl de cDNA fueron introducidos en una mezcla de reacción que contenía tampón de reacción al 1X, dNTPs 0,8 mM, MgCl2 2,5 mM, 5 pmol de cebadores y 1 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores utilizados fueron diseñados mediante el programa informático Oligo 4.0 (NBI, Hamel, MN), y son detallados en la Tabla I. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un termociclador T3 Thermocycler (Whatmann Biometra Gmbh®, Göttingen, Alemania), y el programa utilizado fue el siguiente: 95ºC, 10 min; 30-35 ciclos a 94ºC, 1 min, 60-65ºC, 45 s, 72ºC, 45 s; 72ºC, 10 min. Las condiciones para la RT-PCR de PTEN habían sido previamente descritas (Taniyama et al., 2001).

Metilación
RASSF1A apareció metilado en todas las líneas celulares, tanto de astrocitoma como de neuroblastoma (Figura 1-a). MGMT fue el segundo gen que presentó mayor frecuencia de hipermetilación en las líneas celulares, ya que 7 de los 8 astrocitomas que pudieron ser analizados mostraron metilación en al menos un alelo de MGMT (Figura 1-b). Sin embargo, de entre las líneas celulares de neuroblastoma, tan sólo las células SK-N-MC presentaron metilación de uno de los alelos de MGMT.
PTEN apareció hemimetilado en las líneas celulares GOS3 y MOG-G-CCM, mientras que ningún neuroblastoma presentó metilación de este gen (Figura 1-c). En cuanto a p14, ninguna de las líneas de neuroblastoma estudiadas presentó metilación en este gen. Sin embargo, tan sólo las líneas de astrocitoma T98G, LN405, MOG-G-CCM y SW1783 rindieron un resultado analizable, siendo todas ellas negativas para la prueba de metilación. Para p16, ninguna línea de neuroblastoma resultó positiva para la metilación, pero tan sólo pudimos analizar 3 líneas de astrocitoma (LN405, SW1783 y GOS3), sin que ninguna de ellas presentase metilación. Es posible que otro tipo de alteraciones como una deleción homocigótica que abarque los promotores de p14 y/o p16 sea responsable de esta pérdida de información sobre estos genes en los astrocitomas analizados. Sin embargo, esta posibilidad no fue verificada experimentalmente. Los resultados del análisis de metilación son resumidos en la Figura 2.
Expresión
Las líneas celulares U118 y U251 no pudieron ser incluidas en el análisis de expresión debido a la falta de RNA de las mismas.
En el resto de líneas, RASSF1A fue el único gen para el que hubo una correlación casi perfecta entre la metilación del promotor y la pérdida de expresión, ya que casi ninguna de las líneas celulares presentó expresión de este gen, y las que sí (LN405 y SW1088) mostraron una expresión muy reducida cuando era comparada con la expresión en linfocitos de individuos normales (Figura 3-a y 3-b).
Las líneas LN405, U87 MG, SW1088 y GOS3 perdían la expresión de MGMT, mientras que T98G, MOG-G-CCM y SW1783 sí que lo expresaban, pese a que T98G y MOG-G-CCM estaban metiladas para este gen. Todos los neuroblastomas estudiados expresaron MGMT (Figura 3-a y 3-b).
En cuanto a PTEN, todas las líneas celulares (tanto de astrocitoma como de neuroblastoma) mostraron expresión, con la excepción de SW1088, que no expresó (Figura 3-a y 3-b). Sin embargo, esta pérdida de expresión en esta línea celular nada tiene que ver con la metilación del promotor, puesto que comprobamos que SW1088 presentaba una deleción homocigótica que afectaba la región codificante de PTEN (datos no mostrados).
En cuanto a p16 y p14, todas las líneas de neuroblastoma expresaron p14/ARF, mientras que tan sólo SK-N-DZ, SK-N-MC, MC-IXC y BE(2)C mostraron expresión de p16/INK4A (Figura 3-b). Sin embargo, ninguna de las líneas de neuroblastoma que perdían la expresión de p16 presentó metilación en su promotor, lo cual nos lleva a pensar que otros mecanismos de inactivación distintos a la hipermetilación pueden ser responsables de la pérdida de expresión de p16 en estas líneas celulares.
En el grupo de líneas celulares de astrocitoma, sólo LN405, MOG-G-CCM y SW1783 presentaron expresión de estos dos genes simultáneamente, mientras que el resto de líneas celulares perdían la expresión de ambos (Figura 3-a). Nuevamente, consideramos que otros mecanismos distintos a la hipermetilación (probablemente deleciones homocigóticas) pueden ser responsables de la pérdida de expresión de estos genes en líneas celulares de astrocitoma.

El gen RASSF1A fue el que presentó una mayor frecuencia de metilación en todas las líneas, y, además el único en el que la correlación entre la metilación del promotor y la pérdida o reducción en la expresión fue casi perfecta. Posiblemente, la inactivación de este gen por hipermetilación tenga un papel importante en la etiología de tumores del sistema nervioso.
MGMT presentó una elevada frecuencia de metilación en las líneas de astrocitoma, pero no así en las de neuroblastoma, en las que la inactivación de este gen no parece ser importante. Sin embargo, las líneas T98G y MOG-G-CCM presentaron expresión de este gen a pesar de tener un alelo metilado. Algo similar ocurrió para PTEN, el cual, pese a tener un alelo metilado en las líneas de astrocitoma GOS3 y MOG-G-CCM, se expresaba en ellas de un modo similar al del resto de células. Tres posibilidades se nos ocurren para explicar este fenómeno: a) que la presencia de una única copia intacta del gen sea suficiente en estas líneas celulares para, mediante mecanismos celulares de compensación, dar un nivel de expresión normal; b) que la metilación de la isla CpG del promotor de estos genes no sea suficiente para provocar el silenciamiento del gen en estas líneas celulares; y c) que la técnica empleada no haya sido capaz de detectar una reducción cuantitativa en el nivel de expresión de estos genes. Para poder decantarnos por una de estas tres posibilidades, sería necesario realizar un ensayo de cuantificación de la expresión, bien por PCR semicuantitativa, bien por PCR a tiempo real.
En cuanto a p14 y p16, la metilación de estos genes no parece jugar un papel importante en las líneas celulares de neuroblastoma ni en las de astrocitoma. Sin embargo, en muchas de estas últimas, no se pudieron analizar los resultados de MSP. Es posible que pérdidas homocigóticas que afectasen al promotor de alguno de estos genes fuesen responsables de este fenómeno, así como de la posterior pérdida de expresión de estos genes en esas mismas líneas celulares. Asimismo, hubo muchas líneas de neuroblastoma que no expresaron p16, a pesar de no mostrar evidencias de metilación en su promotor. Esto puede ser explicado por la existencia de otros mecanismos diferentes a la hipermetilación (deleciones homocigóticas, mutaciones, etc.) reponsables de la pérdida de expresión de este gen.
Por fin, observamos que, si bien los patrones de hipermetilación que adoptan las líneas celulares para estos genes son similares a los presentes en tumores primarios (el gen RASSF1A aparece frecuentemente metilado tanto en neuroblastomas como en astrocitomas, mientras que la metilación de PTEN y, sobre todo, MGMT, es más característica en astrocitomas), la frecuencia con que aparecen metilados es mucho mayor que la encontrada en tumores primarios. Esto ha sido también observado muy recientemente por Paz y cols. (Paz et al., 2003).
La mayor frecuencia de hipermetilación observada en las líneas celulares con respecto a los tumores primarios puede explicarse por la ventaja selectiva que la inactivación epigenética de ciertos genes puede conferir a la célula cancerosa; por eso se irían seleccionando clones que presenten mayores frecuencias de metilación de genes supresores tumorales. Sin embargo, el hecho de que el patrón de metilación que presentan las líneas celulares sea similar al observado en tumores primarios puede ser un indicador de la importancia de la metilación de determinados genes para cada línea celular; de este modo, el análisis de la metilación en líneas celulares puede proporcionarnos un modelo de estudio que habrá de ser posteriormente aplicado a los tumores primarios.

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