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Introducción y Objetivo
DMBT1 ha sido propuesto como un importante gen supresor tumoral que suele presentar pérdida o reducción en su expresión en muchos tipos de cáncer. Recientemente, observamos cómo dos líneas celulares de neuroblastoma perdían la expresión de este gen, mientras que una de ellas (MC-IXC) volvía a expresarlo tras ser tratada con un agente demetilante. Para comprobar si DMBT1 puede verse silenciado por hipermetilación, estudiamos el estado de metilación de tres dominios CC(A ó T)GG de su promotor mediante enzimas de restricción sensibles a metilación. Recientemente se ha visto asociación entre la metilación de estos dominios y el silenciamiento de TP53 en leucemia aguda linfoblástica.
Material y Métodos
Siete líneas celulares de neuroblastoma, una de glioblastoma y una línea de astrocitos normales (NHA) fueron digeridas con la enzima de restricción EcoR II (sensible a metilación y con diana en las secuencias CC(A ó T)GG), y posteriormente se realizaron dos PCRs: una de ellas para un fragmento que contenía dos dominios CC(A ó T)GG; en la otra, (M2), el fragmento amplificado contenía un único dominio CC(A ó T)GG. Para cada muestra fueron realizados dos controles: digerido con BstN I (insensible a metilación), y sin digerir.
Resultados
La línea NHA (con expresión normal de DMBT1) no presentó metilación en ninguno de los dominios, mientras que otras líneas que expresaban el gen también presentaron metilación en uno de los dominios o en los dos (U87). La línea MHH-NB-11 (con expresión muy reducida de DMBT1) presentó metilación en M2, mientras que MC-IXC (que no expresa DMBT1), no mostró evidencias de metilación en ninguno de sus dominios.
Conclusión
La metilación de los dominios CC(A ó T)GG del promotor de DMBT1 no parece estar asociada a reducción en su expresión. Posiblemente algún regulador positivo de la expresión de DMBT1 pueda verse inactivado por hipermetilación.

La región cromosómica 10q25.3 presenta una elevada frecuencia de pérdidas en astrocitomas de alto grado (1,2). Dentro de esta región son varios los genes cuya inactivación podría favorecer el inicio o la progresión tumoral (MXI-1, Fas, FGFR2…); recientemente, se han descrito con relativa frecuencia alteraciones en el gen DMBT1, no sólo en cáncer de cerebro, sino también en cáncer gastrointestinal, cáncer de esófago, pulmón y un grupo de neuroblastomas (3-7). Las alteraciones más frecuentemente descritas para DMBT1 son las pérdidas homocigóticas y los reordenamientos (5,8), siendo algo más rara la presencia de mutaciones intragénicas (9). Sin embargo, se ha visto una reducción en la expresión de este gen en tumores de colon y pulmón cuando las células tumorales eran comparadas con las células normales que estaban alrededor (10,11); además, muchas líneas celulares de estos tumores presentan pérdida de expresión de este gen (5,11).
En un trabajo anterior (7), nuestro grupo se planteó si la pérdida de expresión de este gen en dos líneas celulares de neuroblastoma (MC-IXC y MHH-NB-11) era debida a la metilación de su promotor. Tras un tratamiento con un agente demetilante (5-Aza-2’-deoxicitidina), tan sólo la línea MC-IXC recuperó la expresión de DMBT1. Así pues, quedaba claro que alteraciones en el patrón de metilación podían afectar negativamente a la expresión de este gen en algunas líneas de neuroblastoma; sin embargo, todavía quedaba por comprobar si este silenciamiento era debido a metilación directa de su promotor.
Objetivos
Nos propusimos comprobar si la pérdida de expresión de DMBT1 en la línea celular MC-IXC era debida a metilación aberrante de su promotor. Para ello, diseñamos un análisis utilizando una enzima de restricción sensible a metilación: esta enzima era EcoR II, con diana de restricción en la secuencia CC(A ó T)GG. Estudios recientes han asociado la presencia de metilación de citosinas en estos dominios con el silenciamiento de TP53 y B29 en leucemia (12,13).

Líneas celulares
Siete líneas celulares de neuroblastoma (BE(2)-C, SK-N-DZ, SK-N-SH, MC-IXC, MHH-NB-11, IMR-32 y SK-N-MC) y 1 de glioblastoma (U87 MG) fueron cultivadas en medio DMEM, suplementado con 10% de FBS, 4% de aminoácidos no esenciales y 1% de penicilina/estreptomicina. La línea celular de astrocitos normales NHA fue cultivada siguiendo las instrucciones del distribuidor (Cambrex, East Rutherford, NJ). El DNA fue extraído mediante el procedimiento de fenol-cloroformo.
Digestiones
1 microgramo de DNA de cada línea celular fue digerido con la enzima EcoR II, en una mezcla que contenía 1,5 microl de solución tampón al 10X y 10 U de enzima, hasta un volumen final de 15 microl. Las reacciones fueron incubadas a 37ºC, durante toda la noche, y a la mañana siguiente se aumentó la temperatura de incubación hasta 72ºC, durante 20 min, para la completa inactivación de la enzima. Para cada muestra fue utilizado un control sin digerir, y otro digerido con la enzima BstN I, que presenta la misma diana de restricción que EcoR II, pero, en este caso, no es sensible a metilación y, por lo tanto, siempre producirá corte. Las reacciones con BstN I fueron también incubadas durante toda la noche, esta vez a 60ºC.
PCRs
Fueron diseñadas dos reacciones de PCR para cada muestra: en la primera de ellas, que denominamos M1, se amplificó un fragmento que contenía dos secuencias diana para la enzima EcoR II, a –930 y –905 pb. del inicio de traducción de DMBT1, respectivamente; en la segunda, que llamamos M2, el fragmento amplificado contenía un dominio CCWGG a –398 pb. del inicio de traducción.
Para amplificar el fragmento M1, 1,5 microl del producto de las digestiones fue incluido en una mezcla de reacción que contenía 2,5 microl solución tampón al 10X, dNTPs 0,8 mM, MgCl2 2,5 mM, 5 pmol de cada cebador y 1 U de enzima AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). El programa de termociclador utilizado fue el siguiente: 10 min a 95ºC para la desnaturalización inicial, seguido de 28 ciclos a 94ºC, 1 min, 52ºC, 45 s y 72ºC, 10 min. Por fin, se empleó un último paso de extensión a 72ºC, 10 min. Para la amplificación del fragmento M2 fueron utilizadas las mismas condiciones que para M1, excepto la temperatura de hibridación, que en este caso fue de 58ºC. Asimismo, para cada muestra fue realizada una PCR en la que se amplificaba el exón 6 de TP53, en cuya secuencia no existe ningún dominio CCWGG, y que fue empleado como referencia de la cantidad de DNA utilizada en cada ensayo. Para amplificar este fragmento, 1,5 microl de cada producto de reacción fueron añadidos a una mezcla que contenía 2,5 microl de tampón al 10X, 0,8 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl2, 5 pmol de cada cebador y 1 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de los cebadores utilizados para las tres PCRs son detalladas en la Tabla 1.

MC-IXC presentó metilación en ambas regiones, mientras que casi todas las líneas celulares examinadas presentaron metilación en al menos uno de los dominios. Las células U87 MG, que expresaban el gen, presentaron metilación en M1 y M2, mientras que otras líneas que también expresaban DMBT1 (Be(2)C, SK-N-DZ, SK-N-SH e IMR32), mostraron metilación en M2. Otras células como SK-N-MC y NHA, que expresaban el gen, no rindieron evidencia alguna de metilación en ninguna de las regiones estudiadas (Figura 2). En cambio, las células MHH-NB-11, que no expresaban DMBT1, sí que tenían metilada la región M2.

Los resultados de este trabajo parecen descartar la metilación en los dominios CCWGG del promotor de DMBT1 como responsable del silenciamiento de este gen en las líneas celulares de neuroblastoma analizadas. Así, mientras que células como las U87 MG, con un nivel de expresión similar al de los astrocitos normales, presentaron metilación en ambas regiones, otras células como MC-IXC no tenían ninguna secuencia metilada.
Sin embargo, no puede descartarse completamente el papel de la metilación aberrante en la pérdida de expresión de DMBT1, ya que las mismas MC-IXC volvían a expresar este gen tras ser tratadas con un agente demetilante (7). Es probable que algún regulador positivo de la expresión de DMBT1 se vea inactivado por hipermetilación de su promotor, y por ello volvemos a observar el transcrito de DMBT1 cuando tratamos estas células con 5-Aza-2’-deoxicitidina.
Hasta el momento, el papel de DMBT1 como supresor tumoral ha sido muy discutido por los distintos autores. Sin embargo, una de las principales causas de este debate es el desconocimiento de la función de este gen por parte de los investigadores; este desconocimiento puede ser principalmente debido a la complejidad de la estructura del gen, que hace difícil su estudio. De este modo, los estudios futuros deberían ir orientados no sólo hacia la función de DMBT1, sino también hacia la regulación de su actividad en condiciones normales y las consecuencias de su disfunción en relación al proceso tumoral. Nuestros trabajos en el campo del control epigenético, así como los de Lualdi y cols. (14), que describieron secuencias reguladoras de expresión en el promotor de DMBT1, pueden constituir un primer paso en la dilucidación de la regulación de DMBT1 y su función en la célula.

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