España

Introducción.
Los genes supresores de tumores sufren silenciamiento transcripcional cuando las islas CpG de sus regiones promotoras portan citosinas metiladas. Hemos analizado dos genes efectores de Ras (RASSF1A y NORE1A), el gen BLU localizado junto a RASF1A en 3p, y el gen de la caspasa 8 en en neuroblastomas primarios y líneas celulares.

Material y métodos.
- Se dispuso de 41 DNAs extraídos de tumores neuroblásticos y 12 líneas celulares de neuroblastoma:
- Se utilizó la técnica de MSP (Methylation Sensitive PCR) para detección de hipermetilación en los promotores de los genes.

Resultados.
En tumores, el porcentaje de metilación fue: RASSF1A (83%), Caspasa 8 (60%), BLU (8%), y NORE1A (3%). En líneas celulares se detectó un 100% de metilación de RASSF1A, caspasa 8 (92%), BLU (58%), y NORE1A (50%). El porcentaje de metilación es mayor en líneas celulares que en tumores, pero se corresponde de más a menos en los 4 genes estudiados.

Conclusiones.
• La metilación de RASSF1A podría constituir una nueva vía de tumorigénesis en neuroblastomas (a través de los efectores de Ras), mientras que la metilación de NORE1A no parece ser un fenómeno frecuente en la génesis de estos tumores.
• La metilación del gen BLU localizado en el cromosoma 3p21.3 (al igual que RASSF1A) no parece estar asociada a la metilación de RASSF1A.
• La metilación del gen CASP8 parece estar asociada al desarrollo del neuroblastoma.

Los tumores neuroblásticos son los tumores sólidos extracraneales más frecuentes durante los dos primeros años de vida. Se localizan en la médula adrenal y ganglios del sistema nervioso simpático. Las lesiones genéticas típicas de estos tumores son la amplificación de MYCN, la deleción de 1p, 11q y 14q (1-4).
Los genes supresores de tumores sufren silenciamiento transcripcional cuando las islas CpG de sus regiones promotoras portan citosinas metiladas (5, 6).
Un gen identificado y clonado recientemente es el efector de Ras denominado RASSF1(7, 8). Se localiza en 3p21.3, locus que sufre frecuentemente LOH en tumores de pulmón y mama (9), entre otros (10-13). RASSF1 tiene tres transcriptos mayores (A, B y C). Se ha observado que RASSF1A presenta hipermetilación aberrante en un porcentaje significativo de carcinomas como son por ejemplo los de mama, ovario y próstata (9-15).
El gen NORE1 humano, situado en 1q32.1, ha sido recientemente descrito como efector de Ras (16). Presenta tres isoformas (A, B y C) de las cuales NORE1A sufre hipermetilación en líneas celulares tumorales de pulmón, mama, colon y riñón (16). Se ha demostrado que RASSF1A homodimeriza y heterodimeriza con Nore1 a través de su segmento aminoterminal no homólogo, y no se une a Ras directamente (17).
El gen BLU (19) se sitúa en 3p21.3, al igual que RASSF1. De hecho, ese locus sufre frecuentemente LOH y deleciones homocigóticas en cáncer de pulmón (18). Existen dos isoformas de BLU, la isoforma de pulmón (12 exones) y la isoforma de testículo (11 exones). BLU comparte un 30% de homología con proteínas de la familia de factores de transcripción MTG/ETO y las supresinas, que se supone regulan la entrada al ciclo celular.
El gen CASP8 se localiza en 2q33-q34 y codifica una cistein-proteasa implicada en la apoptosis. Se ha observado que este gen sufre deleciones e hipermetilación asociada a la amplificación de MYCN en neuroblastomas (20).

Material
Se dispuso de 41 DNAs extraídos de tumores neuroblásticos provenientes del Hospital La Paz de Madrid (España). Asimismo se estudiaron las siguientes líneas celulares de neuroblastoma:
o Kelly: neuroblastoma.
o Sima: neuroblastoma, grado III.
o SK-N-FI: neuroblastoma, metástasis a médula ósea.
o SK-N-MC: neuroblastoma.
o MC-IXC: neuroepitelioma.
o SH-SY5Y: neuroblastoma.
o MHH-NB-11: neuroblastoma.
o SK-N-SH (*): neuroblastoma de sitio metastásico, médula ósea.
o SK-N-DZ: neuroblastoma, metástasis a médula ósea.
o SK-N-BE(2): neuroblastoma, metástasis a médula ósea.
o BE(2)C: neuroblastoma, metástasis a médula ósea.
o IMR-32: neuroblastoma.
Se utilizaron DNAs extraídos de sangre periférica de donantes sanos como controles negativos de metilación. La línea celular SW48 de carcinoma de colon fue utilizada como control positivo de metilación de los genes RASSF1A y NORE1A. En el caso de BLU y CASP8 se utilizó un DNA metilado “in vitro” (CpGenomeTM Universal Methylated DNA, Chemicon) como control positivo de metilación.
Metodología.
- Modificación con bisulfito.
Se trataron tanto las muestras como los controles con bisulfito según el “CpGenomeTM DNA Modification Kit” (Chemicon), de modo que las citosinas no metiladas presentes en el DNA son convertidas en uracilos.
- MSP (Methylation Sensitive PCR) (21).
Los DNAs tras el tratamiento con bisulfito fueron sometidos a dos reacciones de PCR utilizando dos parejas de cebadores específicos de cada gen: una de ellas diseñada bajo la premisa de que no hubiera metilación a nivel del promotor y la otra suponiendo que sí la había.

Los resultados obtenidos tanto en los tumores como en las líneas celulares se resumen en las siguientes tablas y figuras (vease en el apartado Discusion).

• La inactivación de RASSF1A por metilación podría constituir una nueva vía de tumorigénesis en neuroblastomas.
• La metilación de NORE1A no parece ser un fenómeno frecuente en la génesis de estos tumores.
• La metilación del gen BLU localizado en el cromosoma 3p21.3 (al igual que RASSF1A) no parece estar asociada a la metilación de RASSF1A.
• La metilación del gen CASP8 parece estar asociada al desarrollo del neuroblastoma.

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