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INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más frecuente en la infancia. Aunque se han descrito alteraciones frecuentes en el mismo, no existe un gen supresor de tumores específico del neuroblastoma.
En nuestro estudio analizamos dos genes en neuroblastomas: PTEN y DMBT1, localizados en 10q. Son genes que participan frecuentemente en el desarrollo de otros tumores del sistema nervioso, como astrocitomas.

MATERIAL Y MÉTODOS
Dispusimos de 45 tumores primarios de tipo neuroblástico, y de 12 líneas celulares de neuroblastoma.
Realizamos análisis de deleciones homocigóticas (DH) mediante PCR diferencial, así como de expresión mediante RT-PCR.

RESULTADOS
Un 5% de los tumores primarios (2/41) mostraron DH en PTEN, mientras que un 7% (3/41) de tumores, y 2 de 12 líneas celulares mostraron DH en DMBT1, a nivel de su STS g14.
Todas las líneas celulares expresaron PTEN. Dos de ellas mostraron pérdida de expresión de DMBT1 a nivel de mRNA. Tratamos de demostrar si la hipermetilación del promotor de DMBT1 pudiera ser la causa del silenciamiento de expresión de este gen. Las dos líneas celulares se trataron con 5-aza-2’-deoxicitidina, y la expresión de DMBT1 se restauró en una de ellas (línea MC-IXC).

CONCLUSIONES
De nuestro trabajo se concluye que: a) PTEN y DMBT1 contribuyen al desarrollo de una pequeña parte de neuroblastomas, y b) la hipermetilación del promotor de DMBT1 podría participar en el silenciamiento de este gen en neuroblastomas.

Algunas de las alteraciones genéticas más características encontradas en tumores neuroblásticos son la amplificación del oncogén MYCN, las pérdidas alélicas en 1p y las ganancias en 17q, todas ellas asociadas a mal pronóstico de la enfermedad. Otras alteraciones que irían asociadas a buen pronóstico serían las pérdidas alélicas en 11q y 14q, y la sobreexpresión de Trk A (Brodeur, 2003). Con menor frecuencia, se han encontrado otras alteraciones, como las ganancias en 4q, 6p y 18q, o las pérdidas en 10q, especialmente halladas en casos de neuroblastoma familiar (Altura et al., 1997).
La región cromosómica 10q es sujeto de pérdidas alélicas en una gran variedad de tumores, tales como glioblastoma, melanoma o cáncer de próstata o endometrio (Fults et al., 1998; Healy et al., 1998; Leube et al., 2002; Peiffer et al., 1995). Ha sido descrito un gen supresor tumoral (PTEN, Phosphatase and Tensin homolog located at chromosome tEN) localizado en 10q23.3 (Li & Sun, 1997; Li et al., 1997; Steck et al., 1997), que aparece muy frecuentemente mutado o delecionado en un amplio porcentaje de casos; sin embargo, muchos autores proponen la existencia de otra región supresora en el brazo cromosómico 10q, que estaría entre 10q25 y 10qter (Maier et al., 1998; Rasheed et al., 1995). Dentro de esta región, el gen supresor tumoral candidato más estudiado es DMBT1 (Deleted in Malignant Brain Tumors-1 (Mollenhauer et al., 1997)), el cual presenta frecuentes pérdidas homocigóticas, reordenamientos y pérdidas de expresión en glioblastoma, cáncer de pulmón, de esófago y de colon y recto (Mollenhauer et al., 2002c; Mori et al., 1999; Wu et al., 1999). Estos genes han sido, hasta la fecha, muy poco estudiados en neuroblastoma.
Los objetivos planteados en este estudio fueron el análisis de los genes PTEN y DMBT1 en neuroblastomas primarios y líneas celulares; las alteraciones estudiadas: las pérdidas homocigóticas y la pérdida de expresión, ésta última en las líneas celulares.

Tumores primarios y líneas celulares
Se analizaron un total de 45 tumores neuroblásticos (29 neuroblastomas (NB), 12 ganglioneuroblastomas (GNB) y 4 ganglioneuromas (GN)) procedentes del Hospital Infantil La Paz (Madrid), y 12 líneas celulares de neuroblastoma (SK-N-Be(2), SK-N-DZ, SK-N-FI, SK-N-MC, SK-N-SH, KELLY, IMR32, MC-IXC, MHH-NB-11, SH-SY5Y, SIMA y Be(2)C). Las líneas celulares fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% FBS, 4% aminoácidos no esenciales y 1% penicilina/estreptomicina. El DNA fue extraído mediante purificaciones con fenol-cloroformo.

Deleciones homocigóticas
La presencia de pérdidas homocigóticas fue analizada mediante PCR diferencial. Fueron estudiados los exones 2 y 6 del gen PTEN, así como 5 regiones STS internas al gen DMBT1: 74k, 36k, g14/g14ext, 60k y 101n. Para las PCRs diferenciales de PTEN, se partió de 20-50 ng de DNA que fueron introducidos en un tubo de reacción que contenía: tampón de reacción a concentración 1X; dNTPs 0,8 mM; MgCl2 2 mM; 5 pmol de PTEN (exón 2 ó 6); 1,25 pmol GADPH (control interno), y 1 U de BioTaqTM DNA polimerasa (Bioline Ltd., London, UK), hasta un volumen final de 25 microl. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: PTEN exón 2: 5’-GTTTGATTGCTGCATATTTCA-3’ (sentido), y 5’-TCTAAATGAAAACACAACATGAA-3’ (antisentido), 202 pb; PTEN exón 6: 5’-CTTCTCTTTTTTTTCTGTCC-3’ (sentido), y 5´-AAGGATGAGAATTTCAAGCA-3 (antisentido), 191 pb; GAPDH: 5’-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3’ (sentido), y 5’-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3’. El programa utilizado para ambas PCRs diferenciales fue el siguiente: 95ºC, 7 min; 28 ciclos de 94ºC (30 s), 55ºC (30 s) y 72ºC (30 s); 72ºC, 10 min. Las condiciones para la PCR diferencial de DMBT1 habían sido previamente descritas (Mollenhauer et al., 1997).

RT-PCR
El RNA de las 12 líneas celulares de neuroblastoma fue extraído mediante TRIzol® LS Reagent, (InvitrogenTM Life technologies, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. 5 microg de RNA fueron retrotranscritos a cDNA mediante el kit Superscript II RNA retrotranscriptase® (InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA). El cDNA obtenido fue diluido a 1:5, y guardado a –20ºC hasta su posterior uso.
Para el análisis de expresión de DMBT1, 10 microl de este cDNA fueron amplificados en una mezcla de reacción que contenía: tampón de reacción a concentración 1X; MgCl2 1,5 mM; dNTPs 0,8 mM; cebadores (20 pmol para amplificar el fragmento de DMBT1 y 5 pmol para amplificar el control interno (TFR, Transferrin Receptor)); y 2 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA), hasta completar un volumen de 50 microl. El programa utilizado fue el siguiente: 95ºC, 10 min; 40 ciclos a 94ºC, 45 s, 60ºC, 45 s y 72ºC, 2 min; 72ºC, 10 min. Las condiciones para la RT-PCR de PTEN habían sido descritas previamente (Taniyama et al., 2001). Las secuencias de cebadores utilizadas para las RT-PCRs de DMBT1, PTEN y TFR son detalladas en la Tabla I.

Tratamientos con 5-Aza-2'-deoxicitidina
Se quiso comprobar si la pérdida de expresión de alguno de estos genes podía ser debida a un patrón de metilación aberrante; para ello, aquellas líneas celulares que perdían la expresión de PTEN o DMBT1 fueron sembradas en botellas de cultivo a una concentración de 300.000 células/ml, y fueron tratadas con 5-Aza-2’-deoxicitidina a dosis 1 y 2 microM. El tratamiento duró 4 días, con cambio de medio a los dos días. Al finalizar el tratamiento se rascaron las células, y se extrajo el RNA para realizar el estudio de expresión.

PCR diferencial
Los resultados obtenidos tras el análisis de pérdidas homocigóticas son resumidos en la Tabla II. Dos casos analizados de los 41 tumores estudiados presentaron pérdidas homocigóticas en el exón 2 de PTEN (5%), sin que ninguno de los casos estudiados presentase deleción en el exón 6. En cuanto a DMBT1, 3 casos presentaron pérdida homocigótica de la región g14 (7%), sin que ninguna otra región resultase afectada. Ninguna de las muestras que presentaron pérdida homocigótica para alguno de los dos genes tenía deleción simultánea de ambos.
En cuanto a las líneas celulares, ninguna de ellas presentó alteraciones en PTEN, mientras que dos de ellas, SK-N-MC y MC-IXC, mostraron pérdida homocigótica de la región STS g14 de DMBT1.

Expresión
La expresión del transcrito de PTEN pudo observarse en todas las líneas celulares analizadas. En lo que a DMBT1 se refiere, no pudimos obtener un resultado reproducible cuando usábamos una cantidad de RNA de partida de 1 microg, y por ello decidimos subir esta cantidad a 5 microg. Esta aparente falta de reproducibilidad ha sido previamente observada por otros autores (Mollenhauer et al., 2002b), y puede ser debida al bajo nivel de expresión de DMBT1, que podría estar en los límites de detección de la RT-PCR (Figura 2).
Dos líneas celulares mostraron una expresión de DMBT1 muy baja o nula: MHH-NB-11 y MC-IXC. Sin embargo, tan sólo MC-IXC presentaba pérdida homocigótica de una región del gen, mientras que otra línea (SK-N-MC) que presentaba pérdida en la misma región no mostró reducción alguna en la expresión de DMBT1 al ser comparada con otras líneas celulares y un control de astrocitos normales (NHA). Por ello, nos planteamos la posibilidad de que otros mecanismos de inactivación, tales como la metilación aberrante del promotor, fuesen responsables de la pérdida de expresión de este gen en estas líneas celulares.

Tratamientos con 5-Aza-2’ deoxicitidina
Para comprobar este aspecto, decidimos tratar estas dos líneas celulares con dosis de 1 y 2 microM de 5-Aza-2’ deoxicitidina, durante 4 días. La línea MC-IXC respondió a ambos tratamientos, tras los cuales pudo volver a observarse el transcrito de DMBT1 (Figura 3); sin embargo, no observamos variaciones en la línea MHH-NB-11 después de los tratamientos.

Algunos trabajos han descrito 10q como una región alterada en neuroblastomas, implicada en reordenamientos cromosómicos (Lastowska et al., 1997), siendo la región 10q25.3 frecuentemente delecionada en neuroblastoma familiar (Altura et al., 1997).
PTEN, localizado en 10q23.3, ha sido propuesto como un gen supresor tumoral que aparece frecuentemente mutado en glioblastomas, melanomas, y cáncer de próstata, ovario y endometrio (Simpson & Parsons, 2001). En neuroblastomas, este gen ha sido poco estudiado hasta la fecha; un reciente trabajo encontró una mutación con cambio de sentido que resultaba en una proteína truncada en la línea celular de neuroblastoma KP-N-AYR (Moritake et al., 2001).
DMBT1 ha sido propuesto como el principal gen supresor tumoral candidato de la región 10q25, frecuentemente delecionada en astrocitomas de alto grado (Maier et al., 1998). Asimismo, este gen presenta pérdidas homocigóticas y reordenamientos en gran variedad de tumores (Mollenhauer et al., 2001; Mollenhauer et al., 2002c; Wu et al., 1999), siendo la pérdida de expresión una alteración frecuente (Mollenhauer et al., 2002b; Mori et al., 1999). Sin embargo, este gen no ha sido estudiado en tumores neuroblásticos.
Nuestro trabajo describe pérdidas homocigóticas tanto de PTEN como de DMBT1 en un pequeño porcentaje de tumores primarios analizados; además, la frecuencia de pérdidas de DMBT1 parece ser más importante en líneas celulares (2 de 12). Recientemente, Thompson y cols. (Thompson et al., 2001), estudiando pérdidas homocigóticas en la región 1p36 y en 21 loci donde se localizan genes supresores tumorales (incluyendo en el estudio el locus de PTEN, pero no el de DMBT1), tan sólo hallaron 4 casos de deleción homocigótica en 46 líneas celulares de neuroblastoma estudiadas; todos estos casos perdían la región comprendida entre 9p21 y 9p23. Así, el nuestro sería el primer trabajo que encuentra pérdidas homocigóticas en genes localizados en 10q en tumores neuroblásticos.
Muchos autores han descrito pérdidas de expresión de DMBT1 en glioblastoma, cáncer de pulmón, esófago, colon y recto (Mollenhauer et al., 1997; Mori et al., 1999; Wu et al., 1999). Somerville y cols. (Somerville et al., 1998) propusieron que pérdidas homocigóticas en la región 74k, localizada en el extremo N-terminal de DMBT1, podrían ser motivo de la pérdida de expresión del gen; sin embargo, otros autores han propuesto que la pérdida homocigótica encontrada en esta región no es realmente una deleción, sino más bien un artefacto motivado por la presencia de un polimorfismo en la secuencia (Sasaki et al., 2002). En nuestro caso, ninguna de las muestras presentó deleciones en 74k, estando todas ellas presentes en la región g14, que ocupa una posición central dentro del gen (Mollenhauer et al., 1997).
Nos planteamos la posibilidad de que mecanismos epigenéticos de regulación de la expresión del gen, tales como la metilación del promotor, fuesen responsables del silenciamiento del mismo en las líneas MC-IXC y MHH-NB-11. Wu y cols. (Wu et al., 1999), partiendo de un planteamiento similar, intentaron recuperar la expresión de DMBT1 en dos líneas celulares de cáncer de pulmón que no lo expresaban, mediante un tratamiento con 5-Aza-2’ deoxicitina; sin embargo, este grupo no consiguió volver a ver el transcrito, y concluyó que la metilación aberrante no estaba relacionada con la pérdida de expresión de DMBT1 en esas líneas celulares. Nuestro grupo aumentó la dosis de 5-Aza-2’ deoxicitidina hasta 2 microM y el tiempo de tratamiento hasta 4 días, y consiguió reexpresar el gen en una de las dos líneas celulares tratadas, MC-IXC. Es probable que el silenciamiento de DMBT1 en algunos casos de neuroblastoma pueda estar motivado por una disregulación en la metilación del promotor del mismo. Esta hipótesis deberá ser corroborada en futuros estudios, mediante análisis directos de metilación del promotor con enzimas de restricción sensibles a metilación.
La participación de las alteraciones de DMBT1 en el proceso tumoral son todavía un misterio. Dada su posible función como mediador de la respuesta inmune y de la diferenciación celular (Mollenhauer et al., 2000), su compleja estructura, susceptible de sufrir múltiples reordenamientos y deleciones (Mollenhauer et al., 2002c), y su ubicación en una región frecuentemente delecionada en cáncer, es fácil pensar que la inactivación de este gen puede ser determinante en algún momento de la progresión tumoral. Mollenhauer y cols. (Mollenhauer et al., 2000) describieron deleciones alélicas polimórficas de DMBT1 en casi un 10% de la población normal, y propusieron que estas pérdidas podían ser causa de una mayor predisposición a padecer ciertos tipos de cáncer. Sin embargo, Sasaki y cols (Sasaki et al., 2002) no encontraron asociación alguna entre pacientes de astrocitoma que presentaban deleción de DMBT1 frente a los que no presentaban, poniendo en entredicho la participación de este gen en el proceso tumorigénico.
Sin embargo, la presencia de alteraciones de DMBT1 en diversos tipos tumorales sigue siendo una constante. Recientemente, Mollenhauer y cols., propusieron un modelo por el cual alteraciones de la secuencia del gen y cambios en el patrón de expresión podían contribuir al desarrollo del cáncer en el epitelio (Mollenhauer et al., 2002a). El estudio de la regulación de este gen en condiciones normales así como de su función en la fisiología celular será de gran importancia para determinar si la alteración en estas funciones puede de alguna manera contribuir al fenotipo canceroso.

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