Cuba

En nuestro centro se obtuvo el AcM 1E10 (IgG1) al inmunizar ratones Balb/c con el AcM P3 (IgM), que a su vez reconoce específicamente gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado y antígenos presentes en tumores de mama y melanoma. Los resultados obtenidos en modelos singénicos y alogénicos demostraron no sólo las capacidades inmunogénicas del AcM 1E10 sino además sus potencialidades para activar diferentes mecanismos de respuesta antitumoral contra células de tumor mamario y de melanoma.
Fueron utilizados ratones C57BL/6, hembras, inoculados con el Tumor de Lewis metastásico 3LL-D122, vía subcutánea en la almohadilla plantar. Se les administro el preparado vacunal 1E10-Al 50 µg/ animal.
Las muestras de tejido del tumor primario y pulmón metastásico fueron procesadas por parafina para la evaluación histológica y estudio inmunohistoquímico.
La vacunación con 1E10/Al disminuye la masa tumoral por un aumento significativo de células en apoptosis y disminución del número de vasos sanguíneos, sin incidencia sobre el número de mitosis. Tumor primario y metástasis muestran el mismo comportamiento.
En este trabajo se muestra un posible mecanismo de acción del preparado vacunal 1E10/Al desarrollado en el modelo de metástasis espontáneas del carcinoma murino 3LL-D122.

La inmunoterapia activa específica ha tenido un gran auge para el tratamiento de enfermedades malignas fundamentado principalmente en el éxito limitado de las terapias convencionales en la mayoría de los pacientes con cáncer.
A partir de la Teoría de la Red Idiotípica planteada por Jerne en 1974, donde se presenta al sistema inmune como una compleja red de idiotopos interactuantes que se encuentran en equilibrio hasta la llegada del antígeno, han sido desarrollados varios enfoques de vacunas contra numerosas moléculas antigénicas, entre ellas las asociadas a tumores
En nuestro centro se obtuvo el AcM 1E10 (IgG1) al inmunizar ratones Balb/c con el AcM P3 (IgM), que a su vez reconoce específicamente gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado y antígenos presentes en tumores de mama y melanoma. (2)
Los resultados obtenidos en modelos singénicos y alogénicos demostraron no sólo las capacidades inmunogénicas del AcM 1E10 sino además sus potencialidades para activar diferentes mecanismos de respuesta antitumoral contra células de tumor mamario y de melanoma.
El objetivo de este trabajo es estudiar posible mecanismo de acción del preparado vacunal 1E10/Al desarrollado en el modelo de metastásis espontáneas del carcinoma murino 3LL-D122.

Animales y línea tumoral
Se utilizaron ratones de la cepa C57BL/6, hembras, entre 8-10 semanas con un peso de 18-20g procedentes del CENPALAB y mantenidos en el Bioterio del Centro de Inmunología Molecular (CIM) según todas las normas ISO.

Se utilizó la línea murina metastásica del tumor de Lewis 3LL-D122. Las células fueron cultivadas en medio DMEM (Gibco life technologies) al 10% de suero fetal bovino (SFB) (Hyclone). Los animales recibieron 200000 células en PBS en un volumen de 200 uL por vía subcutánea en la almohadilla plantar derecha.
Obtención del preparado vacunal.
El AcM 1E10 fue purificado a partir de líquido ascítico producido en el Bioterio del Centro de Inmunología Molecular y en el CENPALAB, utilizando el inóculo celular de los hibridomas producidos en el área estéril del laboratorio de Hibridomas del Departamento de Ingeniería de Anticuerpos del CIM.
La obtención del preparado vacunal se realizó en el área estéril de la División de Desarrollo de la Dirección de Investigaciones del CIM. En condiciones estériles se mezclaron concentraciones de 2 mg del AcM 1E10 y 5 mg del gel de alúmina/mL, la mezcla se incubó a temperatura ambiente bajo flujo laminar durante 3 horas con agitación suave. El preparado vacunal se conservó a 4C hasta el momento de su uso para la inmunización.
Esquema de inmunización. El esquema de inmunización tanto para el preparado vacunal (1E10/Al, 50 ug por animal) como para el PBS/Al (control negativo) fue administrado por vía subcutánea en el lomo de los animales en un volumen de 200 uL.
Para los experimentos antitumorales los animales (9 por cada grupo), fueron vacunados cada 14 días con dos dosis antes de inoculado el tumor y dos dosis posterior al reto tumoral. Una vez que el tumor alcanzó un volumen de 8-9 mm se realizó la cirugía con el fin de retirar el tumor primario y 27 días después los animales fueron sacrificados para ver la aparición de las metástasis pulmonares y toma de muestra para ser analizados por histología e inmunohistoquímica.
1-Los pulmones fueron pesados y su valor fue tomado como referencia de numero de metástasis.
Procesamiento Histológico e Inmunohistoquímico:
Las muestras para el estudio histológico fueron tomadas del tumor primario y de las metástasis pulmonares. Los fragmentos fueron fijados en formol neutro tamponado al 10 % y se procesaron por el método de inclusión y corte por parafina.
2-Análisis histológico y de la proliferación celular mediante el conteo de figuras mitóticas. Se realizó la tinción de hematoxilina-eosina.
3-Estudio Inmunohistoquímico.
Para el estudio Inmunohistoquímico de la Apoptosis se utilizó el kit de Apoptag 1 y para la Angiogénesis se utilizó el Anticuerpo Monoclonal anti-PECAM-1/CD31 (purified rat anti-mouse CD31 (PECAM-1) (Pharmigen), como secundario un anticuerpo biotinilado de conejo anti-ratón (DAKO), se utilizó el complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa (DAKO) y 3,3 Diaminobenzidina (DAKO) como cromógeno. Se utilizó como contraste la hematoxilina.
Lectura: Se contaron 10 campos por cada muestra con lente de 40X. Las observaciones se realizaron en un microscopio Karl-Zeiss.
Análisis Estadístico: Se utilizó el test estadístico U de Mann-Whitney.

1- La vacunación con el preparado vacunal 1E10/Al disminuye la incidencia de metástasis pulmonares en el modelo metastásico de Lewis
Los animales fueron vacunados cada 14 días con una dosis de 50 ug con el preparado vacunal 1E10/Al y los animales controles con PBS, con el objetivo de conocer si la vacunación tenía incidencia en la aparición de metástasis pulmonares.
El peso de los pulmones de los animales vacunados con 1E10/Al fue significativamente menor que el de los animales vacunados con PBS (p<0.05). Estas diferencias nos indican la efectividad de la vacunación con 1E10/Al en la disminución de metástasis pulmonares en este modelo metastásico (Figuras 1 y 2).
2- La vacunación con 1E10/Al induce apoptosis en las células tumorales sin incidir en la proliferación celular.
No se encontraron diferencias significativas en el conteo de células mitóticas ni en el tumor primario ni en metástasis pulmonares(Fig 3).
Las muestras de tejido de los animales vacunados con 1E10/Al mostraron un número de células apoptóticas significativamente superior a las obtenidas en las muestras de tejido de los animales vacunados con PBS, ocurriendo esto tanto en las muestras del tumor primario como en las muestras de metástasis pulmonares (Figuras 4 y 5). Este comportamiento se mantuvo tanto en el tumor primario como en las metástasis indicando que la tasa de crecimiento de ese tejido tumoral es menor comparada con la tasa de muerte inducida. Estos resultados parecen indicar que el mecanismo de acción de la vacunación con 1E10/Al pudiera deberse a la inducción de apoptosis en las células tumorales.

3- La vacunación con 1E10/Al tiene una incidencia en la formación de nuevos vasos por el tumor.
Para evaluar el efecto de la vacunación con 1E10/Al en la angiogénesis tumoral, las muestras fijadas en parafina fueron analizadas por inmunohistoquímica con un AcM anti-CD31. El inmunomarcaje de los vasos sanguíneos de las muestras del grupo tratado con PBS mostró una mayor densidad vascular tanto en el sitio primario como en metástasis pulmonares (Fig 6). En contraste, en las muestras de tejido de los animales vacunados con el preparado vacunal 1E10/Al hay una significativa disminución de los vasos inmunomarcados. (Fig 7). La angiogénesis tumoral es un factor esencial para el crecimiento y la aparición de metástasis (8), por tanto este puede ser otro posible mecanismo por el cual la vacunación con 1E10/AL está influyendo en la disminución de las metástasis pulmonares.

La inmunoterapia activa con el AcM 1E10/Al induce incremento de la apoptosis tumoral en el sitio primario y las metástasis del modelo Carcinoma Pulmonar 3LL-D122, lo que corrobora su efecto anti-metastásico. Este hallazgo ha sido reportado por nuestro centro [2-5]. Es de significar que el efecto pro-apoptótico ocurre sin modificación de la tasa de crecimiento tumoral, evaluado por la frecuencia comparada respecto al número de mitosis celular de las muestras estudiadas, lo que sustenta un incremento absoluto de este mecanismo de acción antitumoral, similar a lo observado en otras drogas antineoplásicas [6, 7]. Adicionalmente, el efecto antitumoral de la inmunización con el AcM 1E10/Al se asoció a una reducción del número de vasos neoformados, tanto en el tejido tumoral primario y las metástasis pulmonares.
La asociación y potencial sinergismo de los mecanismos antitumorales encontrados consecuentes a la inmunización con el AcM 1E10/Al pueden ser objeto de futuros estudios.

1. Apoptag Plus. In Situ Apoptosis Detection Kit. Peroxidase Catalog # s7101-Kit. Oncor Inc. 1995.
2. Vazquez AM, Perez A, Hernandez AM, Macias A, Alfonso M, Bombino G,Perez R. (1998) Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody. Hybridoma 17(6):527-34.
3. Alfonso M, Diaz A, Hernandez AM, Perez A, Rodriguez E, Bitton R, Perez R,Vazquez AM. (2002) An anti-idiotype vaccine elicits a specific response to N-glycolyl sialic acid residues of glycoconjugates in melanoma patients. J Immunol 168(5):2523-9.
4. Diaz A, Alfonso M, Alonso R, Saurez G, Troche M, Catala M, Diaz RM, Perez R,Vazquez AM. (2003) Immune responses in breast cancer patients immunized with an anti-idiotype antibody mimicking NeuGc-containing gangliosides. Clin Immunol 107(2):80-9.
5. Vazquez AM, Gabri MR, Hernandez AM, Alonso DF, Beausoleil I, Gomez DE,Perez R. (2000) Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides. Oncol Rep 7(4):751-6.
6. Kedar D, Baker CH, Killion JJ, Dinney CP,Fidler IJ. (2002) Blockade of the epidermal growth factor receptor signaling inhibits angiogenesis leading to regression of human renal cell carcinoma growing orthotopically in nude mice. Clin Cancer Res 8(11):3592-600.
7. Bruns CJ, Harbison MT, Davis DW, Portera CA, Tsan R, McConkey DJ, Evans DB, Abbruzzese JL, Hicklin DJ,Radinsky R. (2000) Epidermal growth factor receptor blockade with C225 plus gemcitabine results in regression of human pancreatic carcinoma growing orthotopically in nude mice by antiangiogenic mechanisms. Clin Cancer Res 6(5):1936-48.

8. Jung Y.D, Mansfield P.F, Akagi M, Takeda A, Liu W, Bucana C.D, Hiclin D.J, Ellis L.M. (2002). Effects of combination anti-vascular endothelial factor receptor and anti-epidermal growth factor therapy on the growth of gastric cancer in a nude mouse model. European Journal of cancer 38,1133-40.

El 4/3/2004 16:11, Rosa María Coro Antich dijo:

El 30/3/2004 18:39, Addys dijo: