Chile

INMUNOREACTIVIDAD DE ENOLASA EN EL EPITELIO SEMINIFERO SENIL HUMANO.

El metabolismo energético intracelular compartimentalizado, activa la enzimo enolasa para formar ácido pirúvico. Este, como sustrato energético, debe ingresar a las mitocondrias para continuar al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Sin embargo, durante la proliferación del epitelio seminífero ocurre una redistribución y pérdida citoplasmática progresiva y de disposición de las mitocondrias a nivel del flagelo inicial.
En el presente estudio se describe la inmunoreactividad de la enzimo enolasa presente en las diferentes poblaciones celulares del epitelio seminífero en testículo humano senil, provenientes de un paciente de 70 años sometido a orquiectomía terapeútica subcapsular. El tejido testicular fue fijado inmediatamente en formol tamponado al 10% y mantenido por 12 horas. Luego se procesó por técnicas histológicas corrientes e incluyó en parafina para obtener secciones de 5 micrones. Los cortes obtenidos se trataron con hematoxilina-eosina como tinción topográfica y con anticuerpo para enolasa con revelado de avidina-biotina para inmunohistoquímica. Finalmente se cuantificaron las distintas poblaciones celulares del epitelio seminífero con reacción positiva o negativa. Los resultados preliminares se expresan en porcentaje de células positivas respecto del total de células contadas (40x). Se observó que la totalidad de las células de Sertoli presentaron reacción negativa a enolasa. En el epitelio seminífero se encontró que el 76% de las gonias (tipos A y B) mostraron reacción positiva a enolasa, mientras que en Citos I se redujo al 10% y ausencia total en espermátidas y espermatozoides.
Por lo tanto, las células somáticas (de origen mesodérmico) del epitelio seminífero presentarían isoenzimas enolasas de reactividad diferente en relación con la línea germinal (espermatogonias). Adicionalmente, en la línea germinal la inmunoreactividad a enolasa disminuye mientras progresa la espermatogénesis.

Palabras claves: espermatogénesis, enolasa, epitelio seminífero, inmunohistoquímica.

· Epitelio Seminifero

Los túbulos seminíferos están conformados por células germinales proliferantes y células de sostén no proliferantes. Las primeras corresponden a las espermatogonias y la segundas, a las de Sértoli y mioides o peritubulares. Las espermatogonias se hallan en contacto con la membrana basal del túbulo seminífero y se van acercando hacia el lúmen del mismo en tanto ocurren los distintos estadíos de su maduración, lo que constituye la espermiogénesis; así podemos observar Gonias A pálida y A oscura, gonias B, Citos, espermátidas y espermatozoides(1,2,3) y cuya presencia va variando de acuerdo a los distintos estados fisiológicos del individuo adulto, aunque se considera que el proceso de la espermatogénesis abarca aproximadamente un período de 3 meses.(1) Todo esto se encuentra regulado en mayor o menor medida por la influencia de hormonas gonadotropas, en especial la FSH, que actúa a nivel del epitelio seminífero y es parte activa en su maduración y conservación.(2)

· Senilidad

Es evidente que con la edad los procesos citados tienen alteraciones morfológicas importantes y que son capaces de interferir con la función normal del epitelio seminífero, tales como reducción del diámetro tubular y de la altura epitelial, una notoria disminución de las células de Sértoli, una leve reducción del número de espermatogonias, alteración en la relación gonia/Sértoli, menor porcentaje de espermátidas y espermatozoides por túbulo, mayor grado de vacuolización y soluciones de continuidad epitelial en los túbulos seminíferos seniles,(4-7) siendo algunos de estos cambios histológicos atribuíbles a un patrón predeterminado de envejecimiento y apoptosis celular;(4) variaciones a nivel hormonal de FSH, LH, estradiol y testosterona en el plasma, alteraciones en el eje hipotalámico - pituitario - testicular, implicarían disminución del lumen de los túbulos, esclerosis e insuficiencia vascular.(8,9) No obstante lo anterior, estas modificaciones parecen no influir suficientemente en la espermatogénesis y el sujeto conserva su capacidad fecundante, con espermatozoides móviles de características aparentemente normales.(4,10)

· Inmunoreactividad

Es innegable que la Inmunohistoquímica (IHQ), desde que comenzó a ser utilizada como un método rutinario en los laboratorios, se ha convertido en un elemento decisivo importante para resolver algunos problemas biológicos. Sus técnicas(11-19) están basadas en la visualización de antígenos o anticuerpos, mediante la formación del complejo antígeno-anticuerpo, el cual se pone en evidencia por: a) la conjugación de un colorante fluorescente; o, b) la detección de una enzima en una etapa posterior. Tanto en una como en otra, es requisito fundamental tener presente tres etapas: 1) Preparación del tejido para conservar los antígenos o anticuerpos; 2) Precipitación de estos para su visualización posterior; 3) Preparación del conjugado fluorescente o complejo enzimático, según sea el método utilizado para evidenciar.

· Enolasa

La Enolasa Neurono Específica es la más acídica isoenzimo de las enzimas glicolíticas enolasa y es utilizada como un marcador citoplasmático de neuronas y tejido neuroendocrino.(20) Por lo anterior, se encuentra presente normalmente en las neuronas cerebrales(21,22), nervios periféricos, islotes de Langerhans del páncreas, células de Merkel y células del sistema neuroendocrino (pulmón, páncreas, tracto gastrointestinal, adrenal, pituitaria y melanocitos); y patológicamente en tumores de las células de Merkel, feocromocitoma, paraganglioma, neuroblastoma, adenomas de la pituitaria, melanoma, neurofibroma, schwannoma, carcinoide, nevos, tumores de las células granulares, gastrinoma, carcinomas de ovarios y de mama, léntigo maligno y nevus celular azul.(23) Igualmente se ha descrito en células de Leydig (24-27) y tumores puros y mixtos de testículo.(28,29)

HIPÓTESIS

El metabolismo energético intracelular compartimentalizado, activa la enzimo enolasa para formar ácido pirúvico. Este, como sustrato energético, debe ingresar a las mitocondria para continuar hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Sin embargo, durante la proliferación del epitelio seminífero ocurre una redistribución y pérdida citoplasmática progresiva, así como también de las mitocondria que se sitúan a nivel del flagelo inicial. Se plantea entonces que si la Enolasa participa en este proceso en la catalización de la deshidratación irreversible en la vía glicolítica de 2-fosfoglicerato a agua y fosfoenolpiruvato, precursor directo del ácido pirúvico metabolito fundamental para el aporte energético del ciclo de los ácidos tricarboxilicos, ésta debería estar presente en la línea germinal testicular.

OBJETIVO

Este estudio pretende describir la inmunoreactividad a Enolasa en las poblaciones celulares de testículo senil humano.

· Biológico

Tejido testicular obtenido de un paciente de 70 años, sometido a orquiectomía subcapsular terapeútica por neoplasia prostática sin tratamiento previo.

· Reactivos

- Formalina tamponada al 10%
- Hematoxilina de Harris
- Eosina al 1%
- Enolasa Neurona Específica (Dako, N1516), anticuerpo primario aislado de conejo en 0.05M de buffer Tris-HCl, pH 7.6, con un vehículo proteíco y 15 mM de azida de sodio como preservante y cuyo inmunógeno es un homodímero de 90 kD de peso medio. Su reacción es predominantemente con subunidades gamma de origen neuronal y no presenta reacción cruzada con subunidades alfa.
- Kit de revelado avidina-biotina-complex (LSAB-2, Dako, K0677).

· Procedimientos

Los bloques de tejido fueron fijados por inmersión en formalina tamponada al 10% incluídos en parafina, cortados en micrótomo rotatorio a 5 mm de espesor y montados en portaobjetos pretratados con una solución de Vectabond (Vector Labs). Los cortes obtenidos fueron divididos para estudio morfohistológico topográfico corriente y teñidos con Hematoxilina.-Eosina (H/E); y para evaluación inmunohistoquímica (IHQ), los cuales fueron pretratados con una solución recuperadora de antígenos y luego se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo primario de Enolasa, como marcador. Después se procedió a su revelado siguiendo la técnica estandar con el complejo de avidina-biotina (ABC). La reacción antígeno-anticuerpo fue puesta en evidencia mediante el cromógeno 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), las muestras se montaron en medio hidrófilo permanente Faramount (Dako, S3025) y la verificación de la especificidad de la reacción fue comprobada con controles positivos externos e internos, considerando para esto último a las células de Leydig presentes en los mismos cortes tratados, y controles negativos. Todos los especímenes fueron inhibidos de peroxidasa endógena mediante una exposición previa al proceso de incubaciones, por 5 minutos con peróxido de hidrógeno al 3%.

Posteriormente se procedió a cuantificar el número de células positivas según tipo de población celular, en los túbulos seminíferos cortados transversalmente presentes en las muestras de tejido, siendo n=32.

La inmunoreacción pone en evidencia que en los cortes transversales de los tubulos seminíferos seniles humanos, las células de Sertoli presentan negatividad a la enzimo Enolasa, en tanto que la línea germinativa mostró una positividad de 76% en las gonias A y B, de 10% en espermatocitos I y ausencia total en espermátidas y espermatozoides, como se muestra en el siguiente esquema:

CELULAS ENOLASA POSITIVAS (%)

Túbulos Totales................................ 32
Gonias A + B Positivas................... 76
Cito I - Paquiteno............................. 10
Espermátidas y Espermatozoides... 0
Sértoli................................................... 0

Las fotomicrografías destacan en un fuerte color rojo, dado por el cromógeno 3–amino–9–etilcarbazol (AEC), la inmunoreacción positiva en las células señaladas precedentemente y en las células de Leydig utilizadas como control positivo interno de la reacción.

De acuerdo con los resultados obtenidos, es posible postular que las células de Sértoli, derivados mesodérmicos del epitelio seminífero, presentarían isoenzima Enolasa de reactividad diferente en relación a la que se encuentra presente en la Línea germinal (espermatogonias). Por otra parte, en concordancia con la propia línea germinal, se comprueba que la ENE está presente en las células proliferativas en cantidades que están en directa proporción con el estadío de maduración y que la inmureactividad a Enolasa claramente disminuye mientras progresa la espermatogenensis.

Lo anterior estaría de acuerdo con lo señalado por diversos investigadores en el sentido de que las alteraciones experimentadas por el tejido testicular durante el envejecimiento, se encuentran relacionados con cambios en la expresión de los genes que codifican sus diversas estructuras e igualmente, la presencia de enzimas clave para el desarrollo y reproducciòn celular pueden variar la composición molecular y su distribución en los distintos tipos celulares, aún cumpliendo la misma función.

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El 12/3/2004 15:34, Rosa María Coro Antich dijo: