Cuba

Introducción: Entre los cambios degenerativos que tienen lugar en la vía auditiva como consecuencia de una sordera sensorineural se encuentra la reducción en número de la población neuronal del ganglio espiral, demostrada principalmente en animales recién nacidos. Objetivo: Estudiar la evolución temporal de los cambios que se producen en la densidad neuronal del ganglio espiral de ratas adultas a las que se les indujo una sordera por ototoxicidad. Materiales y métodos: Se utilizaron ratas adultas. La sordera se indujo con kanamicina y furosemida, extrayéndose las cócleas a las 2 y 16 semanas. Mediante técnicas electrofisiológicas se comprobó el estado funcional de la vía auditiva en todos los animales al inicio del estudio, y luego de inducida la sordera en los grupos tratados. Se estudiaron cortes semifinos por microscopia óptica y se determinó la densidad neuronal del ganglio espiral empleando un sistema cubano para morfometría de imágenes. Resultados: El tratamiento con kanamicina y furosemida indujo una reducción de la densidad neuronal del ganglio espiral desde las 2 semanas posteriores al tratamiento. Además de la comprobación de la eficacia del modelo de sordera empleado, la estandarización de las técnicas utilizadas y los cambios degenerativos encontrados hacen que este trabajo sirva de base para estudios posteriores encaminados a lograr la preservación de las células del ganglio espiral en ratas adultas sordas.

Uno de los principales logros de las Neurociencias en las últimas décadas ha sido la creación y desarrollo de técnicas que permiten la recuperación de la función auditiva después que ha ocurrido una pérdida sensorial, a través de prótesis cocleares. Sin embargo, la recuperación de la audición y el re-aprendizaje de funciones relacionadas con la percepción y procesamiento del habla, dependen, en gran medida, del tiempo que media entre la aparición de la sordera y el momento en que se realiza el implante coclear. Durante este período, denominado período de deprivación, comienzan a producirse una serie de cambios plásticos degenerativos que aumentan con el tiempo, entre los que se encuentra la muerte de las células del ganglio ciliar, primera neurona de la vía. La reducción de la población neuronal de esta estructura afecta dramáticamente la eficiencia de los implantes, pues el funcionamiento de estos dispositivos está basado en la estimulación de los axones de estas neuronas (1). Es así que una de las estrategias básicas en las investigaciones del sistema auditivo está encaminada a lograr la supervivencia de la mayor parte de las células ganglionares (2). Sin embargo para la evaluación de cualquier terapia preventiva contra la muerte de estas células es necesario primeramente cuantificar los parámetros de su degeneración. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la evolución temporal de los cambios que se producen en la densidad neuronal del ganglio espiral de ratas adultas a las que se les indujo una sordera por ototoxicidad.

En este trabajo se utilizaron doce ratas Wistar adultas entre 250 y 300g de peso, las cuales fueron subdivididas en cuatro grupos experimentales de 3 animales cada uno: dos grupos de ratas tratadas con ototóxicos y dos grupos de ratas no tratadas (controles). Durante todo el experimento los animales se mantuvieron bajo condiciones ambientales de humedad, temperatura y fotoperíodo. Se les facilitó acceso constante al agua y al alimento.
La ototoxicidad se indujo con la co-administración intraperitoneal de una dosis única de kanamicina (400 mg/kg) y furosemida (150mg/kg).
El estado funcional de la vía auditiva se comprobó en todos los animales aplicando técnicas electrofisiológicas de potenciales evocados transientes de tallo encefálico (PEATC) y potenciales evocados de estado estable (PEAEE). En los grupos de animales tratados se comprobó la instauración de la sordera una semana después de inducida. Se consideraron sordos todos los animales que presentaron umbrales sensoriales superiores a 110 dB nHL.
Las cócleas se extrajeron a las 2 y 16 semanas de inducida la sordera. Se estudiaron animales controles para cada uno de estos tiempos. Para procesar las cócleas se modificó el procedimiento de Freeman et al (3):
- Fijación del animal por perfusión vascular (formalina al 10%)
- Extracción de las cócleas
- Fijación por perfusión perilinfática (paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2% en buffer fosfato de sodio)
- Descalcificación: EDTA al 8.3%
- Postfijación, deshidratación, infiltración e inclusión en bloques de resina Spurr
- Cortes semifinos seriados, tinción con Azúl de Stevenel
- Los cortes semifinos seriados se estudiaron por Microscopia Optica.
Morfometría
Se empleó el sistema cubano Digipat (4) para morfometría de imágenes. De cada animal se hicieron mediciones en
10 cortes a lo largo del caracol, en el plano horizontal Fig_1.
- A pequeño aumento (x10): Determinación del área del canal de Rosenthal correspondiente a la vuelta media de la cóclea
- A mayor aumento (x20): Conteo de los somas neuronales dentro del canal
- Con los dos valores anteriores se cálculo la densidad neuronal (neuronas por mm2)

Procesamiento estadístico
Areas del canal de Rosenthal: ANOVA con la prueba de Tukey Kramer de comparaciones múltiples.
Densidades neuronales: Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn.
Se utilizó el programa estadístico Instat.

A las dos semanas de inducida la sordera: Al estudiar cualitativamente las cócleas no se observaron diferencias en las áreas del canal de Rosenthal. Los procesos periféricos que inervan el órganos de Corti presentaron aspecto normal. Apenas se observaron diferencias de la densidad neuronal entre los animales controles Fig_2) y los sordos de 2 semanas Fig_3a
A las 16 semanas de inducida la sordera: Cualitativamente no se observaron diferencias en las áreas del canal de Rosenthal. Sí se observó reducción notable de la densidad de neuronas en el canal de Rosenthal de la vuelta media de la cóclea, acompañada de degeneración de los procesos periféricos que inervan el órgano de Corti Fig_4a
Morfometría
Las áreas del canal de Rosenthal no mostraron diferencias entre los grupos Tabla_1 y Tabla_2.
TABLA 1 Areas del canal de Rosenthal

GRUPO	N	Media ± DS (en mm2)
Control 2 semanas	30	0.03844 ± 0.01
Sordera 2 semanas	30	0.04156 ± 0.01
Control 16 semanas	30	0.03254 ± 0.00
Sordera 16 semanas	30	0.03730 ± 0.01

TABLA 2 Comparación de las áreas del canal de Rosenthal

COMPARACION	DIFERENCIA	SIGNIFICACION
Control 2s vs Sordera 2s	-0.003111	P>0.05
Control 16s vs Sordera 16s	-0.004757	P>0.05
Sordera 2s vs Sordera 16s	0.004256	P>0.05
Control 2s vs Control 16s	0.005901	P>0.05

El análisis morfométrico mostró que el tratamiento ototóxico indujo una reducción progresiva de la densidad neuronal del ganglio espiral de la cóclea, siendo la disminución a las 16 semanas significativamente mayor que a las 2 semanas de inducción de la sordera (Figuras 3b y 4b). El estudio cuantitativo reveló una disminución significativa de la densidad neuronal a las 2 semanas de sordera, con respecto al control. Es importante destacar que no hubo diferencias significativas entre los dos grupos controles estudiados en cuanto a la densidad neuronal (Tablas 3 y 4).
TABLA 3 Densidades neuronales del ganglio espiral (células/ mm2)

GRUPO	N	MEDIANA	MINIMO	MAXIMO
Control 2 semanas	30	2063.9	1340.9	2542.3
Sordera 2 semanas	30	1610.2	724.3	2232.0
Control 16 semanas	30	2042.2	1522.8	2825.2
Sordera 16 semanas	30	328.3	80.3	713.39

TABLA 4 Comparación de las densidades neuronales del ganglio espiral

COMPARACION	DIFERENCIA DE RANGOS	SIGNIFICACION
Control 2s vs. Sordera 2s	35.4	P<0.001
Control 2s vs. Control 16s	1.5	P>0.05
Sordera 2s vs. Sordera 16 s	36.9	P<0.001
Control 16s vs. Sordera 16 s	70.8	P<0.001

En este trabajo se estudió la vuelta media de la cóclea porque se ha observado (5) un patrón de ototoxicidad en el que las mayores pérdidas neuronales ocurren en este sector.
La degeneración de los procesos periféricos que inervan el órgano de Corti en animales sordos provoca que el sitio de generación de los potenciales de acción tenga que trasladarse hacia el soma de las neuronas del ganglio espiral o al axón central, lo que tiene implicaciones para la aplicación de los implantes cocleares (6).
Los resultados del análisis estadístico, que mostraron que las áreas del canal de Rosenthal son similares en los 4 grupos, concuerdan con lo observado por Leake et al (5).
En este trabajo se demostró que, como consecuencia de una sordera sensorineural inducida en el estadio adulto de ratas por una combinación de kanamicina y furosemida, se produjo una disminución significativa y progresiva en la densidad de neuronas del ganglio espiral desde la segunda semana, lo que corrobora la validez del modelo de ototoxicidad empleado.
Resultados similares han sido obtenidos por varios autores utilizando otras especies de animales, como gatos y curieles ([7, 8, 9, 10]). En estas especies han sido desarrollados diversos procedimientos que han contribuido a profundizar en el conocimiento de los cambios degenerativos que ocurren en la vía auditiva como consecuencia de la sordera. Las técnicas desarrolladas han ayudado a definir e implementar estrategias encaminadas a la preservación de las poblaciones neuronales del ganglio espiral.
A pesar del amplio uso de los modelos de ratas en estudios electrofisiológicos y de biología molecular, este tipo de animal ha sido poco empleado en estudios de sordera, lo que puede estar dado por el tamaño pequeño de sus cócleas y su registro de frecuencias predominantemente altas. Dado su bajo costo de producción, el trabajo con ratas permite llevar a cabo estudios de la evolución temporal de los cambios histológicos y electrofisiológicos presentes en la degeneración.
El hecho de que la densidad neuronal se haya mantenido similar en los controles de 2 y 16 semanas permite concluir que esta variable no sufre efecto de envejecimiento en este período. Entonces, las diferencias significativas encontradas entre el grupo de sordera de 16 semanas con respecto a su control deben atribuirse al daño ototóxico.
Además de la comprobación de la eficacia del modelo de sordera empleado, la estandarización de las técnicas utilizadas y los cambios degenerativos encontrados, hacen que este trabajo sirva de base para estudios posteriores encaminados a lograr la preservación de las células del ganglio espiral en ratas adultas sordas.

AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Carlos Lariot Sánchez y al Ing. Michael Feston Cárdenas, del Laboratorio de Microscopia Electrónica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas, por haber garantizado el buen funcionamiento de todo el equipamiento necesario para la realización de este trabajo.
Agradecemos al Dr. Eddy Sánchez, jefe del Banco de Tejidos del Hospital Frank País, que gentilmente permitió que se realizara en su laboratorio el trabajo de digitalización de imágenes y morfometría.

1. Shepherd R.K. and Hardie N.A. Deafness-Induced Changes in the Auditory Pathway: Implications for Cochlear Implants. Audiol. Neurootol. 2001; 6: 305-18.
2. Leake P.A., Snyder R.L., Rebscher S.J., Hradek G.T., Moore C.M., Vollmer M. and Sato M. Long-Term Effects of Deafness and Chronic Electrical Stimulation of the Cochlea. Cochear Implants, 2000, Chapter 3, 31-41, ed. Waltzman and Cohen, Thieme Medical Publishers, Inc., New York
3. Freeman S, Khvoles R, Cherny L and Sohmer H. Effect of long-term noise exposure on the developing aaand developed ear in the rat. 1999; Audiol. Neurootol. 4: 207-218.
4. Coro Antich RM, Borrajero I. DIGIPAT: Un sistema cubano para morfometría de imágenes. Revista Latinoamericana de Patología. 1996; 34(1): 9 -10 (México).
5. Leake PA, Hradek GT and Snyder RL. Chronic electrical stimulation by a cochlear implant promotes survival in spiral ganglion neurons after neonatal deafeness. 1999; The J. Comparative Neurol 412: 543-562-
6. Shepherd RK, Baxi JH, Hardie NA. Electrical stimulation of the auditory nerve: single neuron strength –duration functions in deafened animals. 2001; Ann. Biomed. Eng.; 29: 195-201.
7. Leake PA, Hradek GT, Rebscher SJ and Snyder RL. Chronic intracochlear electrical stimulation induces selective survival of spiral ganglion neurons in neonatally deafened cats. 1991; Hearing Res, 54: 251-271.
8. Leake PA, Snyder RL, Hradek GT and Rebscher SJ. Consequences of chronic extracochlear electrical stimulation in neonatally deafened cats. 1995; Hearing Res, 82: 65-80.
9. Xu J, Shepherd RK, Millard RE and Clark GM. Chronic electrical stimulation of the auditory nerve at high stimulus rates: a physiological and histopathological study. 1997; Hearing Res 105: 1-29.
10. Araki S, Kawano A, Seldon HL, Shepherd RK, Funasaka S and Clark GM. Effects of chronic electrical stimulation on spiral ganglion neuron survival and size in deafened kittens. 1998; The Laryngoscope. Lippincott-Raven Publishers.

El 12/3/2004 12:43, Lucia González Núñez dijo:

El 12/3/2004 15:35, Rosa María Coro Antich dijo: