Conferencia Invitada: "APOPTOSIS: BASES DEL PROCESO Y SUS
ALTERACIONES, CON ESPECIAL REFERENCIA AL SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE*"
Dr. Tomás Álvaro
Hospital Verge de la Cinta. Servicio de Patología. Tortosa (España) |
* Este trabajo ha sido elaborado en parte gracias a la ayuda concedida por el Fondo de Investigación Sanitaria del Ministerio de Sanidad y Consumo, exp. 98/0066-02.
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Índice
- Resumen
- Síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA)
- Historia clínica
- Estudio histológico
- Estudio inmunohistoquímico
- Comentarios al SLPA
- Apoptosis, sus características y alteraciones
- Introducción
- Mecanismos bioquímicos y morfología
- Mecanismo de apoptosis
- Métodos de detección de apoptosis
- Disregulación de la apoptosis
- Agradecimientos
- Bibliografía
Palabras clave: Síndrome linfoproliferativo
autoinmune; apoptosis; Fas/Fas-L (CD95/CD95L); p53; bcl-2.
Resumen A lo largo de un año cada uno
de nosotros producimos y, en consecuencia eliminamos, una masa celular prácticamente
equivalente al peso de todo nuestro cuerpo. Tomando como ejemplo un caso
clínico-patológico, se realiza una breve revisión actualizada del mecanismo de
apoptosis, sus funciones conocidas, su presentación morfológica y técnicas especiales
de reconocimiento, características bioquímicas, mecanismos, tipos de apoptosis y
enfermedades asociadas a su disregulación, ya sea esta por defecto o por exceso.
SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE
Historia clínica: Niño magrebí de 8
meses de edad que presenta febrícula, anemia, leucocitosis, hipergammaglobulinemia y
adenopatías múltiples.
Múltiples serologías infecciosas
negativas. Citometría de flujo de sangre periférica muestra poblaciones linfocitarias
normales. Mielograma no valorable (sin grumo). Se realiza biopsia de ganglio linfático.
Estudio histológico: El estudio
histológico mostró un ganglio de mediano tamaño ocupado por una proliferación celular
que se distribuye por el espacio paracortical e interfolicular y que presenta una
morfología heterogénea, con elementos celulares de tamaño variable, predominio de
núcleos redondeados o con ligeras indentaciones, observación ocasional de nucléolo en
las células de mayor tamaño, abundante presencia de mitosis y una cantidad amplia de
citoplasma finamente granular. Se observan algunos centros germinales, células
plasmáticas y abundantes estructuras vasculares.
Diapositiva 1: SLPA. El acúmulo de celularidad produce una notable
expansión del espacio interfolicular y zona T. La fotografía incluye un pequeño centro
germinal inmerso en la proliferación celular. H-E.
Diapositiva 2: SLPA. Morfología heterogénea, con elementos celulares de
tamaño variable, predominio de núcleos redondeados o con ligeras indentaciones,
observación ocasional de nucléolo en las células de mayor tamaño, abundante presencia
de mitosis y una cantidad amplia de citoplasma. H-E.
Diapositiva 3: SLPA. Aspecto morfológico tras tinción con Giemsa.
Estudio inmunohistoquímico: El estudio
inmunohistoquímico mostró un inmunofenotipo positivo para CD3, CD5, CD43 y CD57. La
población T resulta doblemente negativa para CD4 y CD8, y CD20 solo pone de
manifiesto restos de centros germinales atrapados. Otros marcadores negativos son Tdt,
CD56, CD30, ALK y EMA. El índice proliferativo evaluado con Ki67 es alto. La
investigación de la presencia de VEB fue negativa por métodos IHQ (LMP-1) e HIS (EBER).
El estudio con PCR para TCR-gamma fue negativo.
Diapositiva 4: SLPA. CD20.
Diapositiva 5: SLPA. CD5.
Diapositiva 6: SLPA. CD57.
Diapositiva 7: SLPA. Tabla resumen de resultados inmunohistoquímicos.
La valoración del grado de apoptosis mediante TUNEL muestra un índice muy
bajo, tanto en la celularidad acumulada como en el interior de los centros germinales
residuales.
Diapositiva 7a: SLPA. TUNEL. Bajo índice apoptótico. La célula en
apoptosis tomada en la foto pertenece al interior de un centro germinal.
Diagnóstico:
SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE
Comentarios al SLPA:
El síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA) resulta de un defecto en la
apoptosis de los linfocitos causado por mutaciones en el gen Fas, que codifica el receptor
para la apoptosis linfocitaria Fas/Apo-1/CD95 (Martin DA, et al. 1999). La
enfermedad también puede deberse a mutaciones en el gen que codifica el ligando de FAS
(FAS-L, CD95L). Estas dos formas de la enfermedad han sido referidas como SLPA tipo 1A y
tipo 1B, respectivamente. Adicionalmente existe un tipo II de SLPA causado por la
mutación del gen de la caspasa 10.
CD95 es una proteína transmembrana que pertenece a la familia del receptor TNF.
La interacción de CD95 con sus ligandos juega un papel fundamental en el control de los
linfocitos periféricos induciendo señales que conducen a la apoptosis. Las mutaciones
heterozigóticas de CD95 conllevan anomalías de la apoptosis tanto de linfocitos normales
como autoreactivos, que son los que se acumulan y producen fenómenos autoinmunes en este
síndrome.
La enfermedad consiste en un cuadro crónico que se hereda de forma autosómica
dominante pero con un alto grado de variabilidad en su expresión clínica. El síndrome
se caracteriza por esplenomegalia, linfadenopatía, hipergammaglobulinemia, autoinmunidad,
linfocitosis B y la expansión de una población inusual de células T, CD3+,
CD4-CD8-, CD45RO-, CD45RA+, CD57+, que expresan el receptor alfa/beta de células T.
Diapositiva 8: SLPA. Clínica.
Histopatológicamente se caracteriza por preservación arquitectural, con
hiperplasia folicular reactiva y marcada expansión paracortical. Esta última puede ser
tan intensa, junto a un índice proliferativo tan alto, que sugieran fuertemente linfoma,
lo que justifica algunas interpretaciones erróneas (ver van der Werff T, et al, 1999) y
aconseja considerar la posibilidad de déficit del sistema Fas/Fas-L en niños con
síndromes linfoproliferativos atípicos inexplicados.
Diapositiva 9: SLPA. Histología.
El mecanismo fisiopatogénico que justifica este cuadro consiste en el acúmulo
de linfocitos T debido al fallo en la apoptosis mediada por FAS. Junto a esta parte
"linfoproliferativa" (término criticado por algunos autores), el fallo en la
apoptosis de los linfocitos B podría ser responsable de los fenómenos autoinmunitarios
que completan el síndrome.
Diapositiva 10: SLPA. Fisiopatogenia.
La definición de las bases moleculares de esta enfermedad no sólo permitió el
reconocimiento de la entidad (síndrome de Canale-Smyth), sino que mostró que las
mutaciones de FAS son compatibles con una supervivencia a largo término, ya que estos
pacientes llegan a la edad adulta, si bien con la posibilidad de desarrollar un amplio
abanico de enfermedades autoinmunes (entre las que destacan la anemia hemolítica y
trombocitopenia) y linfomas, además de episodios intermitentes de linfadenopatía y
esplenomegalia.
Recientemente se ha señalado el hallazgo de déficits de apoptosis mediada por
Fas en ausencia de mutaciones del gen Fas como rasgo familiar predisponente al
padecimiento de enfermedades autoinmunes y cáncer (Ramenghi U, et al. 2000).
APOPTOSIS: SUS CARACTERÍSTICAS Y ALTERACIONES
El SLPA, su componente "linfoproliferativo" y acumulativo, las
alteraciones autoinmunes asociadas, la posibilidad de complicaciones con tumores malignos,
y sus peculiaridades moleculares, que incluyen mutaciones del gen FAS (ya sea del dominio
extracelular o intracelular de CD95), del gen FAS-L, del gen de la caspasa 10, e incluso
el hallazgo de pacientes con un síndrome clínico superponible en los que no se ha
demostrado ninguna de las mutaciones mencionadas, constituye una buena invitación a la
revisión del modelo de apoptosis, sus funciones conocidas, su presentación morfológica
y técnicas especiales de reconocimiento, características bioquímicas, mecanismos, tipos
de apoptosis y enfermedades asociadas a su disregulación, ya sea esta por defecto o por
exceso.
Introducción
Homero utilizaba el término "apoptosis" para referirse a la caída de
las hojas de los árboles en otoño. De aquí, James Cormack, un profesor de griego,
sugirió a Kerr, Wylie y Curie, en el año 1972 el término. Los autores querían señalar
una forma de muerte celular distinta a la necrosis, con características que sugerían un
proceso activo, controlado de forma intrínseca por los tejidos. Los autores reconocieron
que el término "necrosis" era inapropiado para aplicar a esta forma de muerte
celular, que también ocurría en condiciones fisiológicas y cuyo papel destacado
radicaba en regular el tamaño tisular de forma opuesta al papel de las mitosis.
Diapositiva 11: Centro germinal folicular, TUNEL. En condiciones
fisiológicas el mecanismo de muerte celular programada regula el volumen de celularidad y
el tamaño tisular a través de un equilibrio entre proliferación y apoptosis.
(Nota: en este texto se utilizan los términos "necrosis" y
"apoptosis" para referirse a dos procesos diferentes de muerte celular, cuyas
características se especifican más adelante)
Mecanismos bioquímicos y morfología
Los mecanismos bioquímicos implicados en la muerte celular por necrosis
incluyen el agotamiento de ATP, la acción del oxígeno y radicales libres, el efecto del
calcio intracelular y alteraciones de su homeostasis, defectos en la permeabilidad
de la membrana y lesión mitocondrial irreversible. La morfología de la lesión
reversible que en los primeros estadios se manifiesta como edema, hinchazón celular,
cambio hidrópico, degeneración vacuolar, cambio graso y vacuolas lipídicas, progresa en
la necrosis hasta producir los cambios celulares observables microscópicamente y que
siguen a la muerte celular. Estos cambios varían dependiendo del tipo concreto de
necrosis, que suele estar en dependencia tanto del tipo de agresión como del tejido que
responde a la misma.
Así, en la necrosis por coagulación se produce desnaturalización de las
proteínas citoplásmicas, fragmentación de las organelas celulares, hinchazón celular,
eosinofilia, cariolisis, picnosis y cariorrexis.
Diapositiva 12: La necrosis por coagulación se reconoce morfológicamente
por la desnaturalización de las proteínas citoplásmicas, fragmentación de las
organelas celulares, hinchazón celular, eosinofilia, cariolisis, picnosis y cariorrexis.
Cuando las enzimas catalíticas proceden de los lisosomas de las propias células
muertas se utiliza el término autólisis, mientras que cuando la digestión enzimática
se debe a las enzimas de los leucocitos que acuden al foco de necrosis se habla de
heterólisis. En la necrosis licuefactiva, ocurre un predomino de la digestión
enzimática, con acúmulo de restos celulares que constituyen el material purulento. En la
necrosis caseosa, un tipo especial de necrosis coagulativa, se observan restos granulares
amorfos de células coaguladas, fragmentadas, con desaparición de la arquitectura general
del tejido.
Diapositiva 13: En la necrosis caseosa, un tipo especial de necrosis
coagulativa, se observan restos granulares amorfos de células coaguladas, fragmentadas,
con desaparición de la arquitectura general del tejido.
La necrosis grasa no denota en realidad un patrón específico de necrosis.
En todos los casos la desaparición de las células necróticas se produce de forma
gradual a través de un proceso combinado de digestión enzimática, fragmentación y
fagocitosis por los leucocitos.
El mecanismo de muerte celular por apoptosis puede observarse en una amplia
gama de situaciones, entre las que cabe destacar durante el desarrollo, en la homeostasis
de los tejidos, como mecanismo de defensa en reacciones inmunitarias, eliminación de
células lesionadas, envejecimiento, y una extensa variedad de respuestas fisiológicas,
adaptativas y patológicas (embriogénesis, involución dependiente de hormonas, deleción
de poblaciones en proliferación, muerte de células tumorales, muerte de los PNN en
inflamación aguda, muerte de linfocitos B y T, desaparición de células T
autorreactivas, muerte celular inducida por células T citotóxicas, atrofia de órganos
con obstrucción de conductos, enfermedades virales y estímulos nocivos a dosis bajas
como calor, radiación, fármacos e hipoxia). Las manifestaciones características de la
apoptosis reflejan la activación de un aparato intrínseco de muerte celular que ha sido
exquisitamente conservado a través del proceso evolutivo.
La morfología de la muerte celular por apoptosis resulta suficientemente
característica como para ser reconocida con facilidad bajo la observación microscópica,
sin necesidad del uso de procedimientos o técnicas especiales para su reconocimiento. La
célula apoptótica muestra constricción celular, citoplasma denso, agrupamiento de las
organelas, condensación de la cromatina que se agrega en la periferia, formación de
vesículas citoplásmicas y cuerpos apoptóticos (rodeados de membrana, con o sin
fragmentos nucleares) y fagocitosis de las células o cuerpos apoptóticos, en ausencia de
inflamación.
Diapositiva 14: Enfermedad de Kikuchi. La célula apoptótica muestra
constricción celular, citoplasma denso, agrupamiento de las organelas, condensación de
la cromatina que se agrega en la periferia, formación de vesículas citoplásmicas y
cuerpos apoptóticos (rodeados de membrana, con o sin fragmentos nucleares) y fagocitosis
de las células o cuerpos apoptóticos, en ausencia de inflamación.
Las modificaciones bioquímicas de las células apoptóticas subyacentes a los cambios
morfológicos descritos son características e incluyen cambios que se pueden observar
también en las células necróticas y además algunas modificaciones específicas. Son
características la reducción del potencial transmembrana mitocondrial, acidificación
intracelular, producción de especies de oxígeno reactivo, externalización de residuos
de fosfatidilserina en membrana, proteolisis selectiva de un subgrupo de proteínas
celulares y degradación del DNA en fragmentos internucleosomales. El núcleo de este
aparato de muerte celular radica en la fragmentación de proteínas a través de varios
miembros de una familia de proteasas de la cisteína denominadas caspasas (Cryns V,
et al, 1998). La fragmentación de la estructura nuclear y de las proteínas del
citoesqueleto por las caspasas son las responsables de la apariencia morfológica
característica de las células apoptóticas. También la intensa formación de enlaces
cruzados en las proteínas por la activación de la transglutaminasa provoca la
fragmentación característica en cuerpos apoptóticos.
Diapositiva 15: Cuerpos apoptóticos.
La fragmentación del ADN se produce en grandes fragmentos de 50 a 300 kilobases,
seguida de fragmentación en oligonucleosomas múltiplos de 180-200 pb. La acción de
endonucleasas dependientes del Ca2+ y del Mg2+ es la responsable de
esta peculiar fragmentación del ADN y sus típicas escaleras en la visualización por
electroforesis, que aunque no patognomónicas de apoptosis contrastan con el patrón
continuo o en "frotis" indicativo de necrosis.
Finalmente, la expresión de fosfatidilserina y trombospondina en las capas
externas de las membranas plasmáticas permiten el reconocimiento precoz de las células
muertas por apoptosis por los macrófagos. De esta manera se produce la fagocitosis sin
liberación de componentes celulares proinflamatorios, evitando las lesiones residuales o
cicatriciales, a veces con lesión del parénquima adyacente que suele acompañar a la
resolución de la muerte por necrosis.
Mecanismos de apoptosis
Actualmente se reconocen diversos mecanismos que provocan la muerte celular programada
(revisión actualizada en Reed JC, 2000), ya sea a través de agentes lesivos específicos
o una interacción positiva ligando-receptor , o bien a la ausencia de factores tróficos
u hormonales que disparan el proceso. Además existe una relación coordinada,
inversamente proporcional, entre el crecimiento celular y la apoptosis, lo que constituye
un factor determinante del crecimiento tumoral cuando se suprime la muerte celular debido
a fallo del proceso apoptótico.
Las cuatro fases discernibles de acontecimientos moleculares que constituyen el
mecanismo de apoptosis son las siguientes:
1.- Vías de señalización, iniciadoras del proceso. Las señales de los estímulos
apoptóticos pueden ser transmembrana o directamente intracelulares y su efecto puede ser
positivo o negativo. Por ejemplo, algunas señales como hormonas, factores de crecimiento,
citocinas, etc., representan estímulos normales de supervivencia que suprimen la
activación del programa de muerte celular. Es decir, es su ausencia la que determina la
puesta en marcha de la muerte por apoptosis. Por el contrario, reguladores positivos que
generan señales de activación del programa de muerte celular son las interacciones
receptor-ligando, cuyo ejemplo más importante lo constituye la superfamilia del receptor
del Factor de Necrosis Tumoral. Entre los miembros de esta familia algunos inician la
apoptosis, otros la proliferación celular y otros ambas cosas.
Entre las señales intracelulares capaces de generar apoptosis se cuentan los agentes
físicos, la unión de los glucocorticoides a los receptores nucleares y las infecciones
virales, entre otras.
Diapositiva 16: Receptores de estrógenos en cáncer de mama, estímulo de
supervivencia capaz de suprimir la activación de muerte celular programada.
2.- Fases de control e integración, donde diversas moléculas reguladoras estimulan o
inhiben el proceso, determinando su evolución. Aquí deben considerarse dos vías bien
diferenciadas, aunque no excluyentes. La primera de ellas está representada por el modelo
Fas/Fas-ligando(Fas-L). Fas (CD95) es un receptor de la superficie celular y su
ligando, que puede ser soluble o de membrana se denomina Fas-L (CD95L). Fas es posible
encontrarlo en diferentes órganos, tejidos y tumores pero parece incluso de mayor
interés el papel del Fas-L que únicamente está presente en condiciones normales en los
linfocitos T, en las células NK y en lugares muy específicos como la cámara anterior
del ojo, en el epitelio corneal y en testículo.
Diapositiva 17: CD95. En este bloque multitejido se adosan dos tumores de
expresión positiva y negativa extremas de Fas (CD95). Obviamente el lenguaje de ambos con
el sistema inmune y la activación de la apoptosis a través de este mecanismo serán muy
diferentes en ambos. En la actualidad comienza a considerarse este fenómeno en la
elección del tratamiento oncológico individualizado de cada tumor.
No está claro en la actualidad si Fas-L es el responsable de que las células que lo
adquieren (como ocurre en melanoma, cáncer de colon, algunos linfomas, carcinoma de
tiroides y hepatocarcinoma), sean las responsables de que las células tumorales
escapen al efecto inmunológico de las células T citotóxicas y NK a través de un
mecanismo de defensa que implica el ataque por parte de las células tumorales al
propio sistema inmune. Es decir, las células tumorales matan a las células T y NK y así
se libran del sistema de vigilancia inmunológico (ver Gastman BR, 2000). Sin
embargo, parece que, ya sea en líneas celulares que son Fas positivas o Fas
negativas, la incorporación de Fas-L produce detención del crecimiento tumoral, ya sea
en forma de apoptosis en las líneas Fas positivas o a través de inflamación aguda con
polinucleares y monocitos en las líneas que son Fas negativas (Arai H, et al, 1997). El
reconocido papel del oncogén c-myc en condiciones normales como inductor de la apoptosis
para evitar el resurgimiento de tumores requiere la interacción en la superficie celular
de Fas/Fas-L (ver Hueber AO, 1997), mientras que el potencial oncogénico de H-ras puede
residir en su capacidad, no solamente de promover la proliferación celular, sino de
inhibir de forma simultánea la apoptosis inducida por Fas (ver Peli J, et al., 1999). Se
han comunicado déficits de apoptosis mediados por Fas en ausencia de mutaciones del gen
Fas (ver Ramenghi U, et al, 2000), como rasgo familiar predisponente al padecimiento de
enfermedades autoinmunes y cáncer, lo que ha originado el término de enfermedad
linfoproliferativa autoinmune (en contraste con SLPA).
En condiciones normales los linfocitos T citotóxicos reconocen los Ag extraños
expresados en la superficie de las células del huésped, tras lo cual expresan ellas
mismas Fas-L en su superficie, se produce la interacción Fas/Fas-L y se activa el
programa de muerte celular de la célula infectada o anómala. De forma alternativa los
linfocitos T citotóxicos pueden inducir apoptosis mediante la secreción de perforina.
Esta es una molécula transmembrana capaz de formar poros a través de los cuales se
produce una liberación de gránulos citoplásmicos de una proteasa de la serina
denominada granzima B a las células diana. La capacidad de la granzima B de fragmentar
proteínas en los residuos aspartato y de activar diversas caspasas permite a los
linfocitos T citotóxicos destruir las células diana induciendo directamente la fase
efectora de la apoptosis, sin una fase de señalización previa.
Diapositiva 18: CD8. Además de activar la via Fas/Fas-L, los linfocitos T
citotóxicos pueden inducir apoptosis mediante la secreción de perforina y la liberación
de granzima B.
La segunda vía se refiere a los miembros de la familia bcl-2, cuya
regulación apoptótica se debe a su función mitocondrial reguladora (Yang E, et al.,
1996). Cuando el equilibrio habitual de los diferentes miembros de esta familia se inclina
hacia la apoptosis, se producen cambios en la membrana mitocondrial interna conocidos como
transición de permeabilidad mitocondrial, que dan origen a la formación de poros y
tumefacción mitocondrial. El aumento de permeabilidad de las membranas mitocondriales
externas permite la liberación de un potente estimulador de la apoptosis, el citocromo C,
que habitualmente se ubica entre las membranas mitocondriales interna y externa y que
ahora pasa de esa localización al citosol celular, si bien hallazgos recientes sugieren
que este proceso podría ser potencialmente reversible. Las proteínas de la familia bcl-2
que favorecen la apoptosis son Bax y Bad, mientras que las que inhiben el proceso son
Bcl-XL y la propia Bcl-2. Esta última se localiza en la membrana mitocondrial externa, el
retículo endoplásmico y la cubierta nuclear y consigue suprimir la apoptosis tanto
impidiendo el aumento de permeabilidad de la membrana mitocondrial como interaccionando
con el resto de proteínas. En realidad la permeabilidad mitocondrial está determinada
por la formación de dímeros entre miembros proapoptóticos y antiapoptóticos de la
familia bcl-2, de cuyo cociente depende el grado de permeabilidad de la membrana
mitocondrial (Gross A, et al, 1999). Así por ejemplo, se ha demostrado correlación entre
el índice de expresión de bax y bcl-2 con el comportamiento biológico de linfomas no
Hodgkin indolentes y agresivos (ver Wheaton, 1998).
Diapositiva 19: Expresión de bcl-2 en linfoma folicular. Los miembros de
la familia bcl-2 controlan el mecanismo de apoptosis gracias a su función
mitocondrial reguladora.
De forma adicional cabe señalar el papel del gen de supresión tumoral p53 en el
desencadenamiento de la apoptosis debido a lesión del ADN. Esto, que ocurre por ejemplo
tras radiación o administración de agentes quimioterápicos en el tratamiento de
diversas enfermedades neoplásicas, provoca la detención del ciclo celular por el gen p53
en la fase G1 a la espera de la actuación de los correspondientes mecanismos reparadores.
Sin embargo, cuando el proceso de reparación fracasa, p53 desencadena la apoptosis. Todo
esto en condiciones normales, porque cuando p53 sufre mutación o está ausente, lo cual
es muy frecuente en diversos tumores, se produce una situación de crecimiento celular
inapropiado, favorecimiento de la supervivencia celular e inestabilidad genética (Kirsch
DG, et al, 1998). Por el contrario, el correcto funcionamiento de p53 le permite actuar
como supresor tumoral regulando la función de diversos genes, entre los que cabe
mencionar mdm-2, p21, bax, fas y otros.
Diapositiva 20: La mutación de p53 produce una situación de crecimiento
celular inapropiado, favorecimiento de la supervivencia celular e inestabilidad genética.
3.- Fase de ejecución, programa de muerte real a cargo de las caspasas. La cascada
proteolítica de las caspasas representa la vía final donde convergen diversas señales y
mecanismos apoptóticos. El nombre le viene de "c" por proteasa de cisteína y
"aspasa" por su capacidad exclusiva para fragmentar residuos de ácido
aspártico. Se conocen más de diez miembros de esta familia, divididos en dos grupos
básicos, iniciador y de ejecución (puede ampliar este tema en Salvesen et al., 1997).
Las caspasas ejecutivas poseen la capacidad para fragmentar las proteínas del
citoesqueleto y de la matriz nuclear, especialmente las proteínas implicadas en la
transcripción, la replicación y reparación del ADN. Otra familia de proteínas,
denominadas proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP), poseen la propiedad de bloquear el
proceso de muerte celular programada probablemente uniéndose e inhibiendo a las caspasas
(Deveraux QL, et al, 1999).
Diapositiva 21a: Caspasa en linfoma folicular. Compárese con diapositiva
21b.
Diapositiva 21b: Control en amígdala de la tinción de caspasa realizada
en el estudio del linfoma folicular mostrado en la diapositiva 21a.
4.- Eliminación de las células apoptóticas por fagocitosis. La expresión en
superficie de fosfatidilserina y trombospondina, que se desplazan desde la parte interna
de la membrana citoplásmica, facilitan el reconocimiento precoz de las células
apoptóticas por los fagocitos. El proceso es limpio, en ausencia de inflamación, por lo
que las células muertas desaparecen sin dejar cicatriz ni lesionar el parénquima
adyacente. Recientemiente McIlroy D, et al, 2000 han hecho la interesante observación de
que la fragmentación del ADN que ocurre durante la apoptosis también debe ser atribuida
a las DNAasas ácidas lisosomiales de los fagocitos.
Diapositiva 22: Cuerpos apoptóticos, TUNEL. El reconocimiento precoz de
las células apoptóticas por los fagocitos permite un proceso limpio, en ausencia de
inflamación. La fragmentación del ADN que ocurre durante la apoptosis también debe ser
atribuida a las DNAasas ácidas lisosomiales de los fagocitos.
Métodos de detección de apoptosis
Las características morfológicas ya expuestas de las células apoptóticas permiten
su reconocimiento microscópico tras procesamiento y tinción de los tejidos con técnicas
convencionales. Sin embargo se han diseñado una serie de técnicas especiales orientadas
a cuantificar el proceso, entre las que cabe destacar las siguientes:
- Electroforesis de ADN en gel de agarosa. Como queda dicho más arriba las poblaciones
de células apoptóticas ofrecen un típico patrón en escalera fruto de la rotura
internucleosomal del ADN en fragmentos con pesos moleculares múltiplos de 180 pares de
bases.
- Citometría de flujo. Aquí la reducción del tamaño de las células apoptóticas
así como la reducción del contenido en ADN producen una disminución de la luz
reflejada.
- TUNEL (terminal deoxytransferase-mediated bio-dUTP nick-end labelling). Esta técnica
se fundamenta en la presencia de ADN fragmentado en las células apoptóticas para
incorporar nucleótidos biotinilados en el extremo de dichas hebras. El ADN marcado es
visualizado mediante técnica inmunohistoquímica. Esta técnica requiere especial cuidado
en su interpretación, ya que las hebras de ADN partidas de células muertas por necrosis
o autolisis pueden producir resultados falsos positivos, como también puede ocurrir tras
un exceso de digestión proteíca del tejido en el curso de realización de la técnica
(Ansari B, et al, 1993; Gal I, et al, 2000; Tamura t, et al, 2000; Vagunda V, et al,
2000).
Diapositiva 23: La detección de apoptosis mediante TUNEL (terminal
deoxytransferase-mediated bio-dUTP nick-end labelling) se fundamenta en la presencia de
ADN fragmentado para incorporar nucleótidos biotinilados en el extremo de dichas hebras.
- Otras.
Disregulación de la apoptosis
En la actualidad se ha difundido el concepto de disregulación de la apoptosis para
explicar una amplia gama de enfermedades (ver Vaquero M, 2000). Por un lado, la
inhibición de los mecanismos apoptóticos que produce un incremento de la supervivencia
celular permite la supervivencia y la acumulación de células normales y patológicas.
Así ocurre en el síndrome linfoproliferativo autoinmune, con acúmulos celulares por
alteración de la fase control debido a mutaciones del gen Fas o su ligando; y así ocurre
en multitud de tumores malignos, especialmente aquellos con mutaciones del gen p53 y
aquellos en que las vías de señalización positivas permanecen activas, como ocurre con
el efecto de las hormonas en el cáncer de mama o de próstata (ver Reed JC, 1999).
Igualmente, otro gran grupo de enfermedades comprende las alteraciones de la
autoinmunidad, como nuevamente parece suceder en el SLPA con la supervivencia incrementada
de los linfocitos B y T autorreactivos, responsables de las numerosas enfermedades
autoinmunitarias que acompañan el síndrome. Esto es, los defectos del sistema Fas/Fas-L
provocan fallos en la autotolerancia (ver Suda T, et al, 1997).
En el otro lado de la balanza, y apoyando el concepto de disregulación, se encuentran
aquellas enfermedades debidas a un aumento de la apoptosis que provoca una muerte celular
excesiva. Aquí se incluyen las enfermedades neurodegenerativas; la lesión
isquémica, del tipo del infarto de miocardio u otras; la fibrosis pulmonar (Kuwano K, et
al, 1999) o la deplección linfocitaria inducida por virus, cuyo mejor ejemplo es el SIDA
(ver Cossarizza A, et al, 2000). El mismo mecanismo explica la linfopenia y el déficit de
células T del envejecimiento (Aggarwal S, et al, 1998).
Agradecimientos
Deseo agradecer la colaboración del Dr. Emilio Mayayo Artal, del servicio de Anatomía
Patológica del Hospital Joan XXIII, de cuyos archivos procede el material del SLPA
presentado.
Bibliografía
SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE:
- Drappa, J.; Vaishnaw, A. K.; Sullivan, K. E.; Chu, J.-L.; Elkon, K. B. : Fas gene
mutations in the Canale-Smith syndrome, an inherited lymphoproliferative disorder
associated with autoimmunity. New Eng. J. Med. 335: 1643-1649, 1996.
- Fisher, G. H.; Rosenberg, F. J.; Straus, S. E.; Dale, J. K.; Middelton, L. A.; Lin, A.
Y.; Strober, W.; Lenardo, M. J.; Puck, J. M. : Dominant interfering Fas gene mutations
impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Cell 81: 935-946,
1995.
- Illum N, Ralfkiaer E, Pallesen G, Geisler C Phenotypical and functional
characterization of double-negative (CD4-CD8-) alpha beta T-cell receptor positive cells
from an immunodeficient patient. Scand J Immunol 1991; 34: 635-45
- Infante AJ, Britton HA, DeNapoli T, et al. The clinical spectrum in a large kindred with
autoimmune lymphoproliferative syndrome caused by a Fas mutation that impairs lymphocyte
apoptosis. J Pediatr 1998; 133: 629-633.Krammer, P. H. : CD95's deadly mission in the
immune system. Nature 407: 789-795, 2000.
- Lim MS, Straus SE, Dale JK, Fleisher TA, Stetler-Stevenson M, Strober W, Sneller MC,
Puck JM, Lenardo MJ, Elenitoba-Johnson KS, Lin AY, Raffeld M, Jaffe ES. Pathological
findings in human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Am J Pathol
1998;153:1541-50
- Martin DA, Zheng L, Siegel RM, et al. Defective CD95/APO-1/Fas signal complex formation
in the human autoimmune lymphoproliferative syndrome, type Ia. Proc Natl Acad Sci
USA 1999; 96: 4552-4557.
- Nagata, S. : Human autoimmune lymphoproliferative syndrome, a defect in the
apoptosis-inducing Fas receptor: a lesson from the mouse model. J. Hum. Genet. 43: 2-8,
1998.
- Ramenghi U, Bonissoni S, Migliaretti G, et al. Deficiency of the Fas apoptosis pathway
witout Fas gene mutations is a familial trait predisposing to development of autoimmune
diseases and cancer. Blood 2000; 95: 3176-3182.
- Rieux-Laucat, F.; Le Deist, F.; Hivroz, C.; Roberts, I. A. G.; Debatin, K. M.; Fischer,
A.; de Villartay, J. P. : Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative
syndrome and autoimmunity. Science 268: 1347-1349, 1995.
- Sneller MC, Wang J, Dale JK et al. Clinical, inmunologic, and genetic features of an
autoimmune lymphoproliferative syndrome associated with abnormal lymphocyte apoptosis.
Blood 1997; 89: 1341-1348.
- Vaishnaw, A. K.; Orlinick, J. R.; Chu, J.-L.; Krammer, P. H.; Chao, M. V.; Elkton, K. B.
: The molecular basis for apoptotic defects in patients with CD95 (Fas/Apo-1) mutations.
J. Clin. Invest. 103: 355-363, 1999.
- van der Werff T, Bosch J, Delabie J, et al. Revision of the diagnosis of T-zone lymphoma
in the father of a patient with autoimmune lymphoproliferativesyndrome type II. Br J
Haematol 1999; 106: 1045-1048.
APOPTOSIS: SUS CARACTERÍSTICAS Y ALTERACIONES
- Aggarwal S, Gupta S. Increased apoptosis of T cell subsets in aging Humans: altered
expression of Fas (CD95), Fas Ligand, Bcl-2, and Bax. J Immunol 1998; 160: 1627-1637.
- Ansari B, Coates PJ, Greenstein BD, Hall PA. In situ end-labelling detects DNA
strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. J Pathol. 1993
May;170(1):1-8. Arai H, Gordon D, Nabel EG, Nabel GJ. Gene transfer of Fas ligand
induces tumor regression in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 13862-13867.
- Cossarizza A, Stent G, Mussini C, et al. Deregulation of the CD95/CD95L system in
lymphocytes from patients with primary acute HIV infection. AIDS 2000; 14: 345-355.
- Cryns V, Yuan J. Proteases to die for. Genes&Dev 1998; 12: 1551-1570.
- Cummings MC, et al. Apoptosis. Am J Surg Pathol 1997; 21: 88.
- Deveraux QL, Reed JC. IAP family proteins-suppressors of apoptosis. Genes&Dev 1999;
13: 239-252.
- Gal I, Varga T, Szilagyi I, Balazs M, Schlammadinger J, Szabo G Jr. Protease-elicited
TUNEL positivity of non-apoptotic fixed cells. J Histochem Cytochem. 2000
Jul;48(7):963-70.
- Gastman BR, Johnson DE, Whiteside TL, Rabinowich H. Tumor-induced apoptosis of T
lymphocytes: elucidation of intracellular apoptotic events. Blood 2000; 95: 2015-2023.
- Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. Bcl-2 family members and the mitochondria in
apoptosis. Genes&Dev.1999; 13: 1899-1911.
- Hueber AO, Zornig M, Lyon D, et al. Requirement fot CD95 receptor-ligand pathway in
c-Myc-induced apoptosis. Science 1997; 278: 1305-1309.
- Kerr JFR, Wyllie AH, Curie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with
wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: 239-257.
- Kirsch DG, Kastan MB. Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and
prognosis. J Clin Oncol 1998; 16: 3158-3168.
- Kuwano K, Hagimoto N, Kawasaki M, et al. Essential roles of the Fas-Fas ligand pathway
in the development of pulmonary fibrosis. J Clin Invest 1999; 104: 13-19.
- McIlroy D, Tanaka M, Sakahira H, et al. An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation
provided by phagocytes. Genes Dev 2000; 14: 549-558.
- Patología celular: Lesión y muerte celulares. En: Cotran RS, Kumar V, Collins T.
Patología estructural y funcional. McGraw-Hill, 2000.
- Peli J, Schröter M, Rudaz C, et al. Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-mediated
apoptosis by downregulating the expresión of Fas. EMBO J 1999; 18: 1824-1831.
- Ramenghi U, Bonissoni S, Migliaretti G, et al. Deficiency of the Fas apoptosis pathway
witout Fas gene mutations is a familial trait predisposing to development of autoimmune
diseases and cancer. Blood 2000; 95: 3176-3182.
- Reed JC. Dysregulation of apoptosis in cancer. J Clin Oncol 1999; 17: 2941-2953.
- Reed JC. Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 2000; 157: 1415-1430).
- Salvesen GS, Dixit VM. Caspases: intracellular signalling by proteolysis. Cell 1997; 88:
347.
- Suda T, Nagata S. Why do defects in the Fas-Fas ligand system cause autoimmunity? J
Allergy Clin Immunol 1997; 100: S97-101.
- Tamura T, Said S, Lu W, Neufeld D. Specificity of TUNEL method depends on duration of
fixation. Biotech Histochem. 2000 Jul;75(4):197-200.
- Vagunda V, Kalabis J, Vagundova M. Correlation between apoptotic figure counting and the
TUNEL technique. Anal Quant Cytol Histol. 2000 Aug;22(4):307-10.
- Vaquero M. Apoptosis: ser o no ser, ésa es la cuestión. Med Clin (Barc) 2000; 114:
144-156.
- Wheaton S, Netser J, Guinee D, et al. Bcl-2 and Bax protein expression in indolent
versus aggressive B-cell non-Hodgkin´s lymphomas. Hum Pathol 1998; 29: 820-825.
- Yang E, Korsmeyer SJ. Molecular thanatopsis: a discourse on the bcl-2 family and cell
death. Blood 1996; 88: 386-401.
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