SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE y APOPTOSIS

Resumen
Síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA)
            Historia clínica
            Estudio histológico
            Estudio inmunohistoquímico
Comentarios al SLPA
Apoptosis, sus características y alteraciones
          Introducción
            Mecanismos bioquímicos y morfología
            Mecanismo de apoptosis
            Métodos de detección de apoptosis
            Disregulación de la apoptosis
Agradecimientos
Bibliografía

Palabras clave: Síndrome linfoproliferativo autoinmune; apoptosis; Fas/Fas-L (CD95/CD95L); p53; bcl-2.

Resumen A lo largo de un año cada uno de nosotros producimos y, en consecuencia eliminamos, una masa celular prácticamente equivalente al peso de todo nuestro cuerpo. Tomando como ejemplo un caso clínico-patológico, se realiza una breve revisión actualizada del mecanismo de apoptosis, sus funciones conocidas, su presentación morfológica y técnicas especiales de reconocimiento, características bioquímicas, mecanismos, tipos de apoptosis y enfermedades asociadas a su disregulación, ya sea esta por defecto o por exceso.

Historia clínica: Niño magrebí de 8 meses de edad que presenta febrícula, anemia, leucocitosis, hipergammaglobulinemia y adenopatías múltiples.
Múltiples serologías infecciosas negativas. Citometría de flujo de sangre periférica muestra poblaciones linfocitarias normales. Mielograma no valorable (sin grumo). Se realiza biopsia de ganglio linfático.

Estudio histológico: El estudio histológico mostró un ganglio de mediano tamaño ocupado por una proliferación celular que se distribuye por el espacio paracortical e interfolicular y que presenta una morfología heterogénea, con elementos celulares de tamaño variable, predominio de núcleos redondeados o con ligeras indentaciones, observación ocasional de nucléolo en las células de mayor tamaño, abundante presencia de mitosis y una cantidad amplia de citoplasma finamente granular. Se observan algunos centros germinales, células plasmáticas y abundantes estructuras vasculares.

Diapositiva 1: SLPA. El acúmulo de celularidad produce una notable expansión del espacio interfolicular y zona T. La fotografía incluye un pequeño centro germinal inmerso en la proliferación celular. H-E.

Diapositiva 2: SLPA. Morfología heterogénea, con elementos celulares de tamaño variable, predominio de núcleos redondeados o con ligeras indentaciones, observación ocasional de nucléolo en las células de mayor tamaño, abundante presencia de mitosis y una cantidad amplia de citoplasma. H-E.

Estudio inmunohistoquímico: El estudio inmunohistoquímico mostró un inmunofenotipo positivo para CD3, CD5, CD43 y CD57. La población T resulta doblemente negativa para CD4 y CD8, y CD20 solo pone de manifiesto restos de centros germinales atrapados. Otros marcadores negativos son Tdt, CD56, CD30, ALK y EMA. El índice proliferativo evaluado con Ki67 es alto. La investigación de la presencia de VEB fue negativa por métodos IHQ (LMP-1) e HIS (EBER). El estudio con PCR para TCR-gamma fue negativo.

La valoración del grado de apoptosis mediante TUNEL muestra un índice muy bajo, tanto en la celularidad acumulada como en el interior de los centros germinales residuales.

Diapositiva 7a: SLPA. TUNEL. Bajo índice apoptótico. La célula en apoptosis tomada en la foto pertenece al interior de un centro germinal.

El síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA) resulta de un defecto en la apoptosis de los linfocitos causado por mutaciones en el gen Fas, que codifica el receptor para la apoptosis linfocitaria Fas/Apo-1/CD95 (Martin DA, et al. 1999). La enfermedad también puede deberse a mutaciones en el gen que codifica el ligando de FAS (FAS-L, CD95L). Estas dos formas de la enfermedad han sido referidas como SLPA tipo 1A y tipo 1B, respectivamente. Adicionalmente existe un tipo II de SLPA causado por la mutación del gen de la caspasa 10.

CD95 es una proteína transmembrana que pertenece a la familia del receptor TNF. La interacción de CD95 con sus ligandos juega un papel fundamental en el control de los linfocitos periféricos induciendo señales que conducen a la apoptosis. Las mutaciones heterozigóticas de CD95 conllevan anomalías de la apoptosis tanto de linfocitos normales como autoreactivos, que son los que se acumulan y producen fenómenos autoinmunes en este síndrome.

La enfermedad consiste en un cuadro crónico que se hereda de forma autosómica dominante pero con un alto grado de variabilidad en su expresión clínica. El síndrome se caracteriza por esplenomegalia, linfadenopatía, hipergammaglobulinemia, autoinmunidad, linfocitosis B y la expansión de una población inusual de células T, CD3+, CD4-CD8-, CD45RO-, CD45RA+, CD57+, que expresan el receptor alfa/beta de células T.

Histopatológicamente se caracteriza por preservación arquitectural, con hiperplasia folicular reactiva y marcada expansión paracortical. Esta última puede ser tan intensa, junto a un índice proliferativo tan alto, que sugieran fuertemente linfoma, lo que justifica algunas interpretaciones erróneas (ver van der Werff T, et al, 1999) y aconseja considerar la posibilidad de déficit del sistema Fas/Fas-L en niños con síndromes linfoproliferativos atípicos inexplicados.

El mecanismo fisiopatogénico que justifica este cuadro consiste en el acúmulo de linfocitos T debido al fallo en la apoptosis mediada por FAS. Junto a esta parte "linfoproliferativa" (término criticado por algunos autores), el fallo en la apoptosis de los linfocitos B podría ser responsable de los fenómenos autoinmunitarios que completan el síndrome.

La definición de las bases moleculares de esta enfermedad no sólo permitió el reconocimiento de la entidad (síndrome de Canale-Smyth), sino que mostró que las mutaciones de FAS son compatibles con una supervivencia a largo término, ya que estos pacientes llegan a la edad adulta, si bien con la posibilidad de desarrollar un amplio abanico de enfermedades autoinmunes (entre las que destacan la anemia hemolítica y trombocitopenia) y linfomas, además de episodios intermitentes de linfadenopatía y esplenomegalia.

Recientemente se ha señalado el hallazgo de déficits de apoptosis mediada por Fas en ausencia de mutaciones del gen Fas como rasgo familiar predisponente al padecimiento de enfermedades autoinmunes y cáncer (Ramenghi U, et al. 2000).

El SLPA, su componente "linfoproliferativo" y acumulativo, las alteraciones autoinmunes asociadas, la posibilidad de complicaciones con tumores malignos, y sus peculiaridades moleculares, que incluyen mutaciones del gen FAS (ya sea del dominio extracelular o intracelular de CD95), del gen FAS-L, del gen de la caspasa 10, e incluso el hallazgo de pacientes con un síndrome clínico superponible en los que no se ha demostrado ninguna de las mutaciones mencionadas, constituye una buena invitación a la revisión del modelo de apoptosis, sus funciones conocidas, su presentación morfológica y técnicas especiales de reconocimiento, características bioquímicas, mecanismos, tipos de apoptosis y enfermedades asociadas a su disregulación, ya sea esta por defecto o por exceso.

Homero utilizaba el término "apoptosis" para referirse a la caída de las hojas de los árboles en otoño. De aquí, James Cormack, un profesor de griego, sugirió a Kerr, Wylie y Curie, en el año 1972 el término. Los autores querían señalar una forma de muerte celular distinta a la necrosis, con características que sugerían un proceso activo, controlado de forma intrínseca por los tejidos. Los autores reconocieron que el término "necrosis" era inapropiado para aplicar a esta forma de muerte celular, que también ocurría en condiciones fisiológicas y cuyo papel destacado radicaba en regular el tamaño tisular de forma opuesta al papel de las mitosis.

Diapositiva 11: Centro germinal folicular, TUNEL. En condiciones fisiológicas el mecanismo de muerte celular programada regula el volumen de celularidad y el tamaño tisular a través de un equilibrio entre proliferación y apoptosis.

(Nota: en este texto se utilizan los términos "necrosis" y "apoptosis" para referirse a dos procesos diferentes de muerte celular, cuyas características se especifican más adelante)

Los mecanismos bioquímicos implicados en la muerte celular por necrosis incluyen el agotamiento de ATP, la acción del oxígeno y radicales libres, el efecto del calcio intracelular y alteraciones de su homeostasis, defectos en la permeabilidad de la membrana y lesión mitocondrial irreversible. La morfología de la lesión reversible que en los primeros estadios se manifiesta como edema, hinchazón celular, cambio hidrópico, degeneración vacuolar, cambio graso y vacuolas lipídicas, progresa en la necrosis hasta producir los cambios celulares observables microscópicamente y que siguen a la muerte celular. Estos cambios varían dependiendo del tipo concreto de necrosis, que suele estar en dependencia tanto del tipo de agresión como del tejido que responde a la misma.

Así, en la necrosis por coagulación se produce desnaturalización de las proteínas citoplásmicas, fragmentación de las organelas celulares, hinchazón celular, eosinofilia, cariolisis, picnosis y cariorrexis.

Diapositiva 12: La necrosis por coagulación se reconoce morfológicamente por la desnaturalización de las proteínas citoplásmicas, fragmentación de las organelas celulares, hinchazón celular, eosinofilia, cariolisis, picnosis y cariorrexis.

Cuando las enzimas catalíticas proceden de los lisosomas de las propias células muertas se utiliza el término autólisis, mientras que cuando la digestión enzimática se debe a las enzimas de los leucocitos que acuden al foco de necrosis se habla de heterólisis. En la necrosis licuefactiva, ocurre un predomino de la digestión enzimática, con acúmulo de restos celulares que constituyen el material purulento. En la necrosis caseosa, un tipo especial de necrosis coagulativa, se observan restos granulares amorfos de células coaguladas, fragmentadas, con desaparición de la arquitectura general del tejido.

Diapositiva 13: En la necrosis caseosa, un tipo especial de necrosis coagulativa, se observan restos granulares amorfos de células coaguladas, fragmentadas, con desaparición de la arquitectura general del tejido.

En todos los casos la desaparición de las células necróticas se produce de forma gradual a través de un proceso combinado de digestión enzimática, fragmentación y fagocitosis por los leucocitos.

El mecanismo de muerte celular por apoptosis puede observarse en una amplia gama de situaciones, entre las que cabe destacar durante el desarrollo, en la homeostasis de los tejidos, como mecanismo de defensa en reacciones inmunitarias, eliminación de células lesionadas, envejecimiento, y una extensa variedad de respuestas fisiológicas, adaptativas y patológicas (embriogénesis, involución dependiente de hormonas, deleción de poblaciones en proliferación, muerte de células tumorales, muerte de los PNN en inflamación aguda, muerte de linfocitos B y T, desaparición de células T autorreactivas, muerte celular inducida por células T citotóxicas, atrofia de órganos con obstrucción de conductos, enfermedades virales y estímulos nocivos a dosis bajas como calor, radiación, fármacos e hipoxia). Las manifestaciones características de la apoptosis reflejan la activación de un aparato intrínseco de muerte celular que ha sido exquisitamente conservado a través del proceso evolutivo.

La morfología de la muerte celular por apoptosis resulta suficientemente característica como para ser reconocida con facilidad bajo la observación microscópica, sin necesidad del uso de procedimientos o técnicas especiales para su reconocimiento. La célula apoptótica muestra constricción celular, citoplasma denso, agrupamiento de las organelas, condensación de la cromatina que se agrega en la periferia, formación de vesículas citoplásmicas y cuerpos apoptóticos (rodeados de membrana, con o sin fragmentos nucleares) y fagocitosis de las células o cuerpos apoptóticos, en ausencia de inflamación.

Diapositiva 14: Enfermedad de Kikuchi. La célula apoptótica muestra constricción celular, citoplasma denso, agrupamiento de las organelas, condensación de la cromatina que se agrega en la periferia, formación de vesículas citoplásmicas y cuerpos apoptóticos (rodeados de membrana, con o sin fragmentos nucleares) y fagocitosis de las células o cuerpos apoptóticos, en ausencia de inflamación.

Las modificaciones bioquímicas de las células apoptóticas subyacentes a los cambios morfológicos descritos son características e incluyen cambios que se pueden observar también en las células necróticas y además algunas modificaciones específicas. Son características la reducción del potencial transmembrana mitocondrial, acidificación intracelular, producción de especies de oxígeno reactivo, externalización de residuos de fosfatidilserina en membrana, proteolisis selectiva de un subgrupo de proteínas celulares y degradación del DNA en fragmentos internucleosomales. El núcleo de este aparato de muerte celular radica en la fragmentación de proteínas a través de varios miembros de una familia de proteasas de la cisteína denominadas caspasas (Cryns V, et al, 1998). La fragmentación de la estructura nuclear y de las proteínas del citoesqueleto por las caspasas son las responsables de la apariencia morfológica característica de las células apoptóticas. También la intensa formación de enlaces cruzados en las proteínas por la activación de la transglutaminasa provoca la fragmentación característica en cuerpos apoptóticos.

La fragmentación del ADN se produce en grandes fragmentos de 50 a 300 kilobases, seguida de fragmentación en oligonucleosomas múltiplos de 180-200 pb. La acción de endonucleasas dependientes del Ca²⁺ y del Mg²⁺ es la responsable de esta peculiar fragmentación del ADN y sus típicas escaleras en la visualización por electroforesis, que aunque no patognomónicas de apoptosis contrastan con el patrón continuo o en "frotis" indicativo de necrosis.

Finalmente, la expresión de fosfatidilserina y trombospondina en las capas externas de las membranas plasmáticas permiten el reconocimiento precoz de las células muertas por apoptosis por los macrófagos. De esta manera se produce la fagocitosis sin liberación de componentes celulares proinflamatorios, evitando las lesiones residuales o cicatriciales, a veces con lesión del parénquima adyacente que suele acompañar a la resolución de la muerte por necrosis.

Actualmente se reconocen diversos mecanismos que provocan la muerte celular programada (revisión actualizada en Reed JC, 2000), ya sea a través de agentes lesivos específicos o una interacción positiva ligando-receptor , o bien a la ausencia de factores tróficos u hormonales que disparan el proceso. Además existe una relación coordinada, inversamente proporcional, entre el crecimiento celular y la apoptosis, lo que constituye un factor determinante del crecimiento tumoral cuando se suprime la muerte celular debido a fallo del proceso apoptótico.

Las cuatro fases discernibles de acontecimientos moleculares que constituyen el mecanismo de apoptosis son las siguientes:

1.- Vías de señalización, iniciadoras del proceso. Las señales de los estímulos apoptóticos pueden ser transmembrana o directamente intracelulares y su efecto puede ser positivo o negativo. Por ejemplo, algunas señales como hormonas, factores de crecimiento, citocinas, etc., representan estímulos normales de supervivencia que suprimen la activación del programa de muerte celular. Es decir, es su ausencia la que determina la puesta en marcha de la muerte por apoptosis. Por el contrario, reguladores positivos que generan señales de activación del programa de muerte celular son las interacciones receptor-ligando, cuyo ejemplo más importante lo constituye la superfamilia del receptor del Factor de Necrosis Tumoral. Entre los miembros de esta familia algunos inician la apoptosis, otros la proliferación celular y otros ambas cosas.

Entre las señales intracelulares capaces de generar apoptosis se cuentan los agentes físicos, la unión de los glucocorticoides a los receptores nucleares y las infecciones virales, entre otras.

Diapositiva 16: Receptores de estrógenos en cáncer de mama, estímulo de supervivencia capaz de suprimir la activación de muerte celular programada.

2.- Fases de control e integración, donde diversas moléculas reguladoras estimulan o inhiben el proceso, determinando su evolución. Aquí deben considerarse dos vías bien diferenciadas, aunque no excluyentes. La primera de ellas está representada por el modelo Fas/Fas-ligando(Fas-L). Fas (CD95) es un receptor de la superficie celular y su ligando, que puede ser soluble o de membrana se denomina Fas-L (CD95L). Fas es posible encontrarlo en diferentes órganos, tejidos y tumores pero parece incluso de mayor interés el papel del Fas-L que únicamente está presente en condiciones normales en los linfocitos T, en las células NK y en lugares muy específicos como la cámara anterior del ojo, en el epitelio corneal y en testículo.

Diapositiva 17: CD95. En este bloque multitejido se adosan dos tumores de expresión positiva y negativa extremas de Fas (CD95). Obviamente el lenguaje de ambos con el sistema inmune y la activación de la apoptosis a través de este mecanismo serán muy diferentes en ambos. En la actualidad comienza a considerarse este fenómeno en la elección del tratamiento oncológico individualizado de cada tumor.

No está claro en la actualidad si Fas-L es el responsable de que las células que lo adquieren (como ocurre en melanoma, cáncer de colon, algunos linfomas, carcinoma de tiroides y hepatocarcinoma), sean las responsables de que las células tumorales escapen al efecto inmunológico de las células T citotóxicas y NK a través de un mecanismo de defensa que implica el ataque por parte de las células tumorales al propio sistema inmune. Es decir, las células tumorales matan a las células T y NK y así se libran del sistema de vigilancia inmunológico (ver Gastman BR, 2000). Sin embargo, parece que, ya sea en líneas celulares que son Fas positivas o Fas negativas, la incorporación de Fas-L produce detención del crecimiento tumoral, ya sea en forma de apoptosis en las líneas Fas positivas o a través de inflamación aguda con polinucleares y monocitos en las líneas que son Fas negativas (Arai H, et al, 1997). El reconocido papel del oncogén c-myc en condiciones normales como inductor de la apoptosis para evitar el resurgimiento de tumores requiere la interacción en la superficie celular de Fas/Fas-L (ver Hueber AO, 1997), mientras que el potencial oncogénico de H-ras puede residir en su capacidad, no solamente de promover la proliferación celular, sino de inhibir de forma simultánea la apoptosis inducida por Fas (ver Peli J, et al., 1999). Se han comunicado déficits de apoptosis mediados por Fas en ausencia de mutaciones del gen Fas (ver Ramenghi U, et al, 2000), como rasgo familiar predisponente al padecimiento de enfermedades autoinmunes y cáncer, lo que ha originado el término de enfermedad linfoproliferativa autoinmune (en contraste con SLPA).

En condiciones normales los linfocitos T citotóxicos reconocen los Ag extraños expresados en la superficie de las células del huésped, tras lo cual expresan ellas mismas Fas-L en su superficie, se produce la interacción Fas/Fas-L y se activa el programa de muerte celular de la célula infectada o anómala. De forma alternativa los linfocitos T citotóxicos pueden inducir apoptosis mediante la secreción de perforina. Esta es una molécula transmembrana capaz de formar poros a través de los cuales se produce una liberación de gránulos citoplásmicos de una proteasa de la serina denominada granzima B a las células diana. La capacidad de la granzima B de fragmentar proteínas en los residuos aspartato y de activar diversas caspasas permite a los linfocitos T citotóxicos destruir las células diana induciendo directamente la fase efectora de la apoptosis, sin una fase de señalización previa.

Diapositiva 18: CD8. Además de activar la via Fas/Fas-L, los linfocitos T citotóxicos pueden inducir apoptosis mediante la secreción de perforina y la liberación de granzima B.

La segunda vía se refiere a los miembros de la familia bcl-2, cuya regulación apoptótica se debe a su función mitocondrial reguladora (Yang E, et al., 1996). Cuando el equilibrio habitual de los diferentes miembros de esta familia se inclina hacia la apoptosis, se producen cambios en la membrana mitocondrial interna conocidos como transición de permeabilidad mitocondrial, que dan origen a la formación de poros y tumefacción mitocondrial. El aumento de permeabilidad de las membranas mitocondriales externas permite la liberación de un potente estimulador de la apoptosis, el citocromo C, que habitualmente se ubica entre las membranas mitocondriales interna y externa y que ahora pasa de esa localización al citosol celular, si bien hallazgos recientes sugieren que este proceso podría ser potencialmente reversible. Las proteínas de la familia bcl-2 que favorecen la apoptosis son Bax y Bad, mientras que las que inhiben el proceso son Bcl-XL y la propia Bcl-2. Esta última se localiza en la membrana mitocondrial externa, el retículo endoplásmico y la cubierta nuclear y consigue suprimir la apoptosis tanto impidiendo el aumento de permeabilidad de la membrana mitocondrial como interaccionando con el resto de proteínas. En realidad la permeabilidad mitocondrial está determinada por la formación de dímeros entre miembros proapoptóticos y antiapoptóticos de la familia bcl-2, de cuyo cociente depende el grado de permeabilidad de la membrana mitocondrial (Gross A, et al, 1999). Así por ejemplo, se ha demostrado correlación entre el índice de expresión de bax y bcl-2 con el comportamiento biológico de linfomas no Hodgkin indolentes y agresivos (ver Wheaton, 1998).

Diapositiva 19: Expresión de bcl-2 en linfoma folicular. Los miembros de la familia bcl-2 controlan el mecanismo de apoptosis gracias a su función mitocondrial reguladora.

De forma adicional cabe señalar el papel del gen de supresión tumoral p53 en el desencadenamiento de la apoptosis debido a lesión del ADN. Esto, que ocurre por ejemplo tras radiación o administración de agentes quimioterápicos en el tratamiento de diversas enfermedades neoplásicas, provoca la detención del ciclo celular por el gen p53 en la fase G1 a la espera de la actuación de los correspondientes mecanismos reparadores. Sin embargo, cuando el proceso de reparación fracasa, p53 desencadena la apoptosis. Todo esto en condiciones normales, porque cuando p53 sufre mutación o está ausente, lo cual es muy frecuente en diversos tumores, se produce una situación de crecimiento celular inapropiado, favorecimiento de la supervivencia celular e inestabilidad genética (Kirsch DG, et al, 1998). Por el contrario, el correcto funcionamiento de p53 le permite actuar como supresor tumoral regulando la función de diversos genes, entre los que cabe mencionar mdm-2, p21, bax, fas y otros.

Diapositiva 20: La mutación de p53 produce una situación de crecimiento celular inapropiado, favorecimiento de la supervivencia celular e inestabilidad genética.

3.- Fase de ejecución, programa de muerte real a cargo de las caspasas. La cascada proteolítica de las caspasas representa la vía final donde convergen diversas señales y mecanismos apoptóticos. El nombre le viene de "c" por proteasa de cisteína y "aspasa" por su capacidad exclusiva para fragmentar residuos de ácido aspártico. Se conocen más de diez miembros de esta familia, divididos en dos grupos básicos, iniciador y de ejecución (puede ampliar este tema en Salvesen et al., 1997). Las caspasas ejecutivas poseen la capacidad para fragmentar las proteínas del citoesqueleto y de la matriz nuclear, especialmente las proteínas implicadas en la transcripción, la replicación y reparación del ADN. Otra familia de proteínas, denominadas proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP), poseen la propiedad de bloquear el proceso de muerte celular programada probablemente uniéndose e inhibiendo a las caspasas (Deveraux QL, et al, 1999).

Diapositiva 21b: Control en amígdala de la tinción de caspasa realizada en el estudio del linfoma folicular mostrado en la diapositiva 21a.

4.- Eliminación de las células apoptóticas por fagocitosis. La expresión en superficie de fosfatidilserina y trombospondina, que se desplazan desde la parte interna de la membrana citoplásmica, facilitan el reconocimiento precoz de las células apoptóticas por los fagocitos. El proceso es limpio, en ausencia de inflamación, por lo que las células muertas desaparecen sin dejar cicatriz ni lesionar el parénquima adyacente. Recientemiente McIlroy D, et al, 2000 han hecho la interesante observación de que la fragmentación del ADN que ocurre durante la apoptosis también debe ser atribuida a las DNAasas ácidas lisosomiales de los fagocitos.

Diapositiva 22: Cuerpos apoptóticos, TUNEL. El reconocimiento precoz de las células apoptóticas por los fagocitos permite un proceso limpio, en ausencia de inflamación. La fragmentación del ADN que ocurre durante la apoptosis también debe ser atribuida a las DNAasas ácidas lisosomiales de los fagocitos.

Las características morfológicas ya expuestas de las células apoptóticas permiten su reconocimiento microscópico tras procesamiento y tinción de los tejidos con técnicas convencionales. Sin embargo se han diseñado una serie de técnicas especiales orientadas a cuantificar el proceso, entre las que cabe destacar las siguientes:

- Electroforesis de ADN en gel de agarosa. Como queda dicho más arriba las poblaciones de células apoptóticas ofrecen un típico patrón en escalera fruto de la rotura internucleosomal del ADN en fragmentos con pesos moleculares múltiplos de 180 pares de bases.

- Citometría de flujo. Aquí la reducción del tamaño de las células apoptóticas así como la reducción del contenido en ADN producen una disminución de la luz reflejada.

- TUNEL (terminal deoxytransferase-mediated bio-dUTP nick-end labelling). Esta técnica se fundamenta en la presencia de ADN fragmentado en las células apoptóticas para incorporar nucleótidos biotinilados en el extremo de dichas hebras. El ADN marcado es visualizado mediante técnica inmunohistoquímica. Esta técnica requiere especial cuidado en su interpretación, ya que las hebras de ADN partidas de células muertas por necrosis o autolisis pueden producir resultados falsos positivos, como también puede ocurrir tras un exceso de digestión proteíca del tejido en el curso de realización de la técnica (Ansari B, et al, 1993; Gal I, et al, 2000; Tamura t, et al, 2000; Vagunda V, et al, 2000).

Diapositiva 23: La detección de apoptosis mediante TUNEL (terminal deoxytransferase-mediated bio-dUTP nick-end labelling) se fundamenta en la presencia de ADN fragmentado para incorporar nucleótidos biotinilados en el extremo de dichas hebras.

En la actualidad se ha difundido el concepto de disregulación de la apoptosis para explicar una amplia gama de enfermedades (ver Vaquero M, 2000). Por un lado, la inhibición de los mecanismos apoptóticos que produce un incremento de la supervivencia celular permite la supervivencia y la acumulación de células normales y patológicas. Así ocurre en el síndrome linfoproliferativo autoinmune, con acúmulos celulares por alteración de la fase control debido a mutaciones del gen Fas o su ligando; y así ocurre en multitud de tumores malignos, especialmente aquellos con mutaciones del gen p53 y aquellos en que las vías de señalización positivas permanecen activas, como ocurre con el efecto de las hormonas en el cáncer de mama o de próstata (ver Reed JC, 1999). Igualmente, otro gran grupo de enfermedades comprende las alteraciones de la autoinmunidad, como nuevamente parece suceder en el SLPA con la supervivencia incrementada de los linfocitos B y T autorreactivos, responsables de las numerosas enfermedades autoinmunitarias que acompañan el síndrome. Esto es, los defectos del sistema Fas/Fas-L provocan fallos en la autotolerancia (ver Suda T, et al, 1997).

En el otro lado de la balanza, y apoyando el concepto de disregulación, se encuentran aquellas enfermedades debidas a un aumento de la apoptosis que provoca una muerte celular excesiva. Aquí se incluyen las enfermedades neurodegenerativas; la lesión isquémica, del tipo del infarto de miocardio u otras; la fibrosis pulmonar (Kuwano K, et al, 1999) o la deplección linfocitaria inducida por virus, cuyo mejor ejemplo es el SIDA (ver Cossarizza A, et al, 2000). El mismo mecanismo explica la linfopenia y el déficit de células T del envejecimiento (Aggarwal S, et al, 1998).

Deseo agradecer la colaboración del Dr. Emilio Mayayo Artal, del servicio de Anatomía Patológica del Hospital Joan XXIII, de cuyos archivos procede el material del SLPA presentado.