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Página Principal Comunicaciones	EXPRESIÓN DE COLAGENASA-3 (MMP-13) EN EL CÁNCER GÁSTRICO: UN ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO. MD Jose M del Casar , Dr. Francisco Vizoso Piñeiro , MD Arancha Martin , MD Richard Gava , MD Luis O Gonzalez , MD Ezequiel Cuesta y MD M Cruz Diez Servicio de Cirugía General, Medicina Familiar y Comunitaria y Anatomia Patologica del Hospital de Jove, Gijón. Asturias España
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen INTRODUCCIÓN: La colagenasa-3 (MMP-13) es una metaloproteasa con una potente actividad degradativa contra varios elementos de la matriz extracelular. Se ha descrito su expresión en algunos carcinomas humanos, donde parece desempeñar un papel en la progresión tumoral y la aparición de metástasis. OBJETIVOS: Investigar la expresión y la significación clínica de la MMP-13 en carcinomas gástricos. MATERIAL Y MÉTODOS: La expresión de MMP-13 fue analizada por método inmunohistoquímico en los tumores de 44 pacientes tratados quirúrgicamente por adenocarcinoma gástrico, que fueron sometidos a un periodo de seguimiento clínico de 18,4 meses. RESULTADOS: Un total de 14 carcinomas gástricos (31,8%) mostraron una tinción inmunohistoquímica positiva para la MMP-13. El porcentaje de tumores positivos para en enzima fue significativamente (p = 0,009) más elevado en los carcinomas en estadio IV (69,2%) en realción con los carcinomas con estadíos más inferiores (I: 22,2%; II: 12,5%; III: 14,3%), así como también en los tumores no resecables (R1 y R2) (61,5%) en relación con los resecables (R0) (19,4%) (p = 0,017). Asimismo, la expresión tumoral de MMP-13 estuvo significativamente asociada con una menor supervivencia total en el conjunto de los pacientes ( p = 0,0008) y en el subgrupo de pacientes con carcinomas resecables ( p = 0,018). CONCLUSIONES: Nuestros resultados sugieren que la expresión tumoral de MMP-13 está asociada con una mayor agresividad tumoral en el cáncer gástrico.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción El proceso de invasión tumoral y de metástasis requiere la degradación proteolítica de los diferentes componentes macromoleculares de la membrana basal y de la matriz extracelular. Existe las evidencia creciente de que las metaloproteinasas representan un tipo de proteasas que desempeñan un papel relevante en la facilitación de la progresión de las neoplasias malignas debido a su capacidad de degradar el tejido conectivo del organismo a pH neutro. De todas las MMPs, los miembros de la superfamilia de las colagenasas son las principales proteasas neutras con capacidad de degradar las fibrillas de colágeno. Hasta la fecha, se han identificado cuatro colagenasas: colagenasa fibroblástica (MMP-1), colagenasa neutrofílica (MMP-8), MT1-MMP (MMP-14)(1) y la más recientemente descubierta colagenasa-3 (MMP-13)(2). La MMP-13 muestra una secuencia proteica idéntica en más de un 50% a las otras tres colagenasas2. Sin embargo, presenta diferencias en la especificidad de sustrato. Así, la caracterización bioquímica de la MMP-13 ha revelado que degrada preferentemente el colágeno tipo II(3,4). No obstante, también se ha demostrado que el enzima es capaz de degradar otras proteínas de la matriz extracelular, como los colágenos tipo IV, X, y XIV; fibronectina; tenascina, y fibrilina (5,6). La MMP-13 fue inicialmente descubierta en el cáncer de mama2. Posteriormente también fue hallada sobreexpresada en otros tumores malignos, tales como condrosarcoma (7),carcinoma de cabeza y cuello (8,9), carcinomas escamosos de la piel(10), melanomas malignos(11), carcinomas de vulva(12) y, más recientemente, en carcinomas de vejiga urinaria(13) y de esófago (14). Los objetivos del presente estudio fueron investigar, mediante análisis inmunohistoquímico, la expresión de MMP-13 en una serie de carcinomas gástricos; la relación de esa expresión con las características clinicopatológicas de los tumores y con el pronóstico de los pacientes.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Pacientes. Este estudio fue realizado sobre una serie de 44 pacientes diagnosticados y tratados de adenocarcinoma gástrico en el Hospital de Jove de Gijón, entre Enero de 1994 y Diciembre de 1998. Todos los pacientes fueron sometidos a tratamiento quirúrgico. De ellos, 24 a gastrectomía subtotal y 20 a gastrectomía total. Un total de 31 pacientes mostraron tumores quirúrgicamente resecables (R0), mientras que en los restantes 13 pacientes sus tumores no fueron quirúrgicamente resecables (R1 o R2) de acuerdo a los criterios de la UICC15. Ningún paciente recibió tratamiento posoperatorio con quimioterapia. Tras la cirugía, los pacientes fueron sometidos a controles clínicos cada 3 meses durante el primer año, y más tarde cada 6 meses. Purificación de la colaganasa-3 y obtención de anticuerpos. La colagnasa-3 se produjo a partir de bacterias recombinantes2. Posterormente, el anticuerpo se obtuvo mediante la inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda16. Para ello, se inyectaron intradérmicamente y en múltiples zonas, 10μg de colagenasa-3 disuelta en 0,5 ml de PBS y emulsionado con igual volumen de adyuvante completo de Freud. Los conejos fueron sangrados a las 6 semanas tyras las inyecciones, y el suero dializado a 4ºC durante 24 horas contra tampón fosfato 20mM, pH 7,2. Finalmente, el material obtenido fue cromatografiado en una columna de DEAE-celulosa equlibrada y eluida en el misma tampón. Las fracciones de IgG se conservaron a –20ºC hasta su posterior utilización. Preparación de las muestras y tinción inmunohistoquímica. La tinción inmunohistoquímica se realizó sobre cortes de 5μ de los bloques de parafina siguiendo el método biotina-streptavidina mediante el sistema Supersensitive (Biogenex, San Ramón CA U.S.A). La presencia del enzima fue revelada con Fast Red en Tris-Buffer con Naftol-Fosfato, y controlando el grado de tinción microscópicamente en la preparación de la mucosa gástrica utilizada como control positivo. El proceso de tinción fue detenido mediante lavado con tampón fosfato pH 7,2. Las preparaciones se contrastaron con hematoxilina de mayer durante 30 segundos y haciéndose virar ésta con agua corriente. Finalmente, las preparaciones fueron montadas con el medio acuoso Aquatex (Merck, Darmstadt, Alemania). Las preparaciones histológicas fueron analizadas por dos patólogos independientes. Las preparaciones fueron consideradas como positivas cuando al menos un 10% de las células tumorales mostranban una tinción inmunohistoquímica positiva para el enzima. Análisis estadístico. La relación entre la tinción inmunohistoquímica para la cologanasa-3 y los factores clínico-patológicos fue examinada mediante el test Chi-Cuadrado con la corrección de Yates. Las curvas de supervivencia fueron calculadas mediante el método de Kaplan y Meier, y comparadas con el test log-rank. El modelo de regresión logística de Cox fue también utilizado para examinar las diferentes combinaciones e interacciones de los factores pronósticos en un análisis multivariante
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados Un total de 14 carcinomas gástricos (31,8%) mostraron una tinción inmunohistioquímica para la colagenasa-3, que se localizó en el citoplasma de al menos el 80% de las células tumorales. Si bien ocasionalmente también observamos una tinción positiva para el enzima en los fibroblastos peritumorales. Por otra parte, no observamos tinción positiva para la colagenasa-3 en el tejido gástrico normal adyacente a los tumores en las preparaciones tisulares. La figura 1 muestra ejemplos de tumores positivos y negativos. En relación con las características de los tumores, los valores de tinción inmunohistoquímica para la colganasa-3 sí mostraron diferencias significativas en función del estadio tumoral y resecabilidad quirúrgica del tumor. Así, el porcentaje de tumores positivos para el enzima fue significativamente ( p = 0,009) más elevado en tumores de estadío IV (69,2%) en relación con los tumores con otros estadíos más inferiores ( I: 22,2%; II: 12,5%; y III: 14,3%). Así mismo, el porcentaje de tumores positivos para la colagenasa-3 fue también significativamente ( p = 0,017) más elevado en los tumores que fueron no resecables quirúrgicamente (R1 y R2) (61,5%) en relación con los resecables (R0) (19,4%). Los valores de expresión de la colagenasa-3 también estuvieron significativamente asociados con una menor supervivencia total de los pacientes. Como se puede comprobar en la figura 2, existieron diferencias significativas entre las curvas de supervivencia total determinadas para esos dos grupos de pacientes ( p = 0,0006). El análisis multivariante demostró que tan sólo el estadío tumoral y los valores de expresión de colagenasa-3 fueron factores pronósticos significativos e independientes para predecir la supervivencia total en el conjunto de los pacientes (tabla 2). En el subgrupo de pacientes con carcinomas gástricos qurúrgicamente resecables, la expresión tumoral de colagenasa-3 estuvo también significativamente asociada con una menor supervivencia total. Como muestra la figura 3, existieron diferencias significativas entre las curvas de supervivencia total determinadas para estos dos grupos de pacientes ( p = 0,018). Por otra parte, el análisis multivariante demostró que la expresión tumoral de colagenasa-3 alcanzó también significación estadística como factor pronóstico independiente en este subgrupo de pacientes (tabla 2). Zoom Figura 1 Carcinomas gástricos con tinción inmunohistoquímica positiva (A) y negativa (B) para la colagenasa-3. Magnification: x100. Zoom Figura 2 Supervivencia total en función de los valores de colagenasa-3 en 44 pacientes con cáncer gástrico. Zoom Figura 3 Supervivencia total en función de los valores de colagenasa-3 en 31 pacientes con cáncer gástrico resecable Zoom Tabla 1 Tinción inmunohistoquímica para la colagenasa- 3 (MMP-13) an carcinomas gástricos clasificados de acuerdo a las diferentes características de los pacientes. Zoom Tabla 2 Análisis multivariante de la asociación entre la tinción inmunohistoquímica para la colagenasa-3 con la supervivencia de 44 pacientes con carcinoma gástrico.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión Este estudio demuestra la expresión tumoral de la MP-13 por un porcentaje significativo (31,8%) de carcinomas gástricos, y que esa expresión enzimática es mostrada por un porcentaje elevado de los tumores con estadío más avanzado. Además, nuestro estudio demuestra que la expresión de MMP-13 por los carcinomas gástricos está significativamente asociada de forma independiente con pronóstico más desfavorable de los pacientes. Nuestros resultados contribuyen a mostrar la evidencia de que los carcinomas gástricos tienen la capacidad de expresar MMPs. Así, hasta la fecha, otros estudios también han descrito la expresión elevada por estos tumores de otras MMPs, tales como la gelatinas A (MMP-2)(17-20), gelatinasa B (MMP-9)(19), matrilisina (MMP-7)(21-22) Y la MT1-MMP (23). Además, en esos estudios se ha encontrado que la expresión de esas MMPs está, en general, asociada con un pronóstico más adverso de los pacientes. Los datos obtenidos en el presente estudio, indicando que la expresión de MMP-13 está asociada con lesiones tumorales gástricas de evolución desfavorable, está, de algún modo, e acuerdo con estudios previos sobre la expresión de esta proteasa en otros tumores. Así, se ha descrito que la sobreexpresión de las MMP-13 en carcinomas de cabeza y cuello está asociada con un incremento de la invasividad local de las células cancerosas (8,9). Más recientemente, también se ha descrito que la expresión de MMP-13 está positiva y significativamente asociada con la invasión vascular, metástasis en nódulos linfáticos, con un estadío tumoral más avanzado, y con una menor supervivencia de los pacientes con cáncer de esófago (14). Todo ello sugiere que la MMP-13 puede tener un papel relevante en la progresión tumoral. Esto parece ser debido, como ya hemos señalado más arriba, a la potente acción degradativa de la proteasa contra variados componentes moleculares de la matriz extracelular. Además, cabe resaltar que se ha demostrado que la expresión tumoral de la MMP-13 se relaciona con la de la gelatinasa A y la MT1-MMP (24), y que también puede ser activada por la plasmina en la superficie de las células tumorales (25). Por tanto, la MMP-13 puede formar parte junto con esas otras de una cascada de MMps capaz de generar una potente actividad colagenolítica. Pero, independientemente de ese efecto directo y sinérgico de la actividad degradativa de la MMP-13 y otras proteasas, que reultan un una facilitación de la invasividad tumoral a través de tejido conectivo y la pared de los vasos sanguíneos, existen datos a favor de que las MMPs pueden tener un papel más amplio durante la progresión tumoral, afectando a procesos básicos tales como el crecimiento neoplásico, apoptosis o angiogénesis(26). Sin embargo, independientemente de todas esas evidencias que apoyan un papel relevante de la MMP-13 en la fisiopatología tumoral, existe en la actualidad controversia en cuanto a la naturaleza y características funcionales de las células que producen la proteasa en las neoplasias humanas. En nuestro estudio la localización morfológica de la expresión del enzima fue predominantemente en las propias células cancerosas, y sólo en algunos fibroblastos del estroma peritumoral. Este mismo patrón de expresión del enzima ha sido descrito en los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (8,9) y de esófago (14). Otros estudios describen la expresión de la MMP-13 exclusivamente por las células tumorales de los melanomas11 o de vejiga urinaria13, mientras que en al cáncer de mama se ha demostrado la expresión del enzima por los miofibroblastos del estroma peritumoral27,28. Es más, se ha demostrado que las células cancerosas del estroma tumoral pueden producir MMP-13 estimuladas por las propias células tumorales, habiéndose identificado como mediadores bioquímicos de esa señal a la interleuquina-12 (IL-12), IL-1β y el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1)(27). Todo ello parece indicar que, dentro del ámbito tisular de los tumores, el tipo celular responsable de la producción de la MMP-13 puede variar de acuerdo a los diferentes tipos de tumores. Otro aspecto relevante es que el efecto finalmente degradativo de las MMPs sobre la matriz extracelular va a depender, en gran mediad, del equilibrio con sis inhibidores naturales (TIMPs)(29). Así pues, el análisis de la expresión o actividad de los TIMPs, que pueden ser producidos por las propias células cancerosas para modular su acción degradativa, o bien por las células del estroma peritumorales como mecanismo defesivo ante la acción devastadora de las MMPs, puede aportar un mejor conocimiento del estatus molecular de la agresividad tumoral y, probablemente, una mayor precisión pronóstica. Además, cabe señalar que la posibilidad de controlar la acción de las MMPs mediante sus inhibidores está generando un gran interés en la investigación oncológica. Si bien la utilización para este propósito de los TIMPs parece tener poca utilidad farmacológica práctica debido a su baja vida media “in vivo” (30), se han sintetizado inhibidores de las MMPs que, como el batimastato y marimastato, presentan actividad anticancerosa (31,32). Así, en el cáncer gástrico avanzado existen ya estudios preliminares que demuestran la actividad anticancerosa del marimastato (33,34). En definitiva, los resultados de este estudio preliminar demuestran la expresión de la MMP-13 por un porcentaje significativo de carcinomas gástricos, y que esa expresión tumoral está asociada con una mayor agresividad tumoral. Por tanto, el análisis de la expresión de esta proteasa puede tener valor pronóstico en este tipo de tumores. Sin embargo, serán necesarios futuros estudios para confirmar los resultados preliminares aquí descritos, así como para investigar también el posible valor de la determinación de la MMP-13 en el cáncer gástrico de cara a seleccionar pacientes candidatos a tratamiento con inhibidores de las MMPs.
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