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Página Principal Comunicaciones	MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL Y NEFROPATOLOGÍA: APLICACIÓN PRÁCTICA EN UN ESTUDIO DE INMUNOFLUORESCENCIA. Dr. Angel Santos-Briz Terrón , Dra. Patricia Antúnez Plaza , Dra. Carmen García Macías , Dra. Teresa Flores Corral , Dra. M. Dolores Ludeña , Dr. Agustín Bullón Sopelana y Dr Miguel Merchán Cifuentes Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario de Salamanca e Instituto de Neurociencias de Castilla y León. España
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen INTRODUCCIÓN: La microscopía láser confocal es una técnica que cada vez cuenta con más usuarios en biomedicina, basada en la estimulación de las muestras por planos focales con un haz de rayo láser. Las técnicas empleadas en microscopía láser confocal son fundamentalmente la fluorescencia y en menor medida la luz reflejada, por lo que sus aplicaciones en el campo de la anatomía patológica son muy limitadas. Presentamos como ejemplo un caso de glomerulonefritis membranosa estudiada por métodos de inmunofluorescencia convencional y microscopía láser confocal. MATERIAL Y MÉTODOS: Se estudió la biopsia renal de una paciente de sexo femenino de 47 años, con síndrome nefrótico y sospecha clínica de glomerulonefritis membranosa. Se realizó tinción inmunohistoquímica de rutina en material en fresco con marcaje de fluoresceína. Para la valoración convencional de la muestra se empleó un microscopio convencional con lámpara de mercurio de 100W. Para el estudio de microscopía láser confocal empleamos un microscopio Leica TCS SP2. RESULTADOS: El estudio de inmunofluorescencia mostró con ambas técnicas la presencia de finos depósitos granulares subepiteliales de IgG, diagnósticos de GNF membranosa. Con la técnica de microscopía láser confocal fue posible identificar dichos depósitos con mucha mayor resolución, a mayor aumento y hacer finos cortes ópticos de la muestra, que posteriormente, con ayuda de un soporte informático permitieron reconstruir tridimensionalmente las asas lesionadas. CONCLUSIONES: La microscopía láser confocal puede ser empleada para el estudio de inmunofluorescencia de biopsias renales. Entre sus ventajas destacan la mayor resolución de sus imágenes, la posibilidad de reconstruir estructuras anatómicas y patrones lesionales tridimensionalmente, la capacidad de cuantificar la señal emitida por el fluorocromo y la posibilidad de estudiar colocalización de proteínas si se emplean tinciones de doble marcaje. Entre sus inconvenientes destacan el que no aporta mayor especificidad ni sensibilidad diagnóstica a la microscopía de fluorescencia habitual. Además, su alto coste prácticamente la descarta como método de diagnóstico rutinario. En resumen, la microscopía láser confocal supone una técnica novedosa con interesantes posibilidades en el campo de la investigación y la docencia, pero que no aporta mejoras significativas en el campo de la nefropatología asistencial.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción La microscopía láser confocal es una técnica que cada vez cuenta con más usuarios en biomedicina, basada en la estimulación de la muestra por planos focales con un haz de rayo láser (1). Las técnicas empleadas en microscopía láser confocal son fundamentalmente la fluorescencia y en menor medida la luz reflejada, por lo que sus aplicaciones en el campo de la anatomía patológica son muy limitadas. Presentamos como ejemplo un caso de glomerulonefritis membranosa estudiada por métodos de inmunofluorescencia convencional y con microscopía láser confocal.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Se estudió la biopsia renal de una paciente de sexo femenino de 47 años, con síndrome nefrótico y sospecha clínica de glomerulonefritis membranosa. Se realizó tinción inmunohistoquímica de rutina en material en fresco con marcaje de fluoresceína. Para la valoración convencional de la muestra se empleó un microscopio convencional con lámpara de mercurio de 100W. Para el estudio de microscopía láser confocal empleamos un microscopio Leica TCS SP2.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados El estudio histológico mostró una corteza renal que comprendía 26 glomérulos valorables y 7 hialinizados. Los primeros mostraban refuerzo mesangial a expensas de la matriz, con carácter focal y segmentario, observándose ocasionalmente engrosamiento de algunas membranas basales. El intersticio presentaba un moderado infiltrado infamatorio en forma de agregados linfocitarios parcheados que focalmente destruían los túbulos. En áreas se observaba fibrosis. Los túbulos mostraban zonas de atrofia, necrosis y tubulitis. Las arterias y arteriolas incluidas en la muestra no presentaban alteraciones morfológicas significativas. El estudio de inmunofluorescencia mostró la presencia de finos depósitos granulares subepiteliales de IgG, diagnósticos de GNF membranosa (Figs 1, 2). Con la técnica de microscopía láser confocal fue posible identificar dichos depósitos con mucha mayor resolución (Fig 3), a mayor aumento y hacer finos cortes ópticos de la muestra (Figs 4 y 5), que posteriormente, con ayuda de un soporte informático permitieron reconstruir tridimensionalmente las asas lesionadas, en forma de proyecciones paralelas (series de imágenes (Fig. 6), imágenes estereológicas (Fig. 7) o videos de movimiento de la estructura, no reproducidas en esta comunicación por el gran tamaño del archivo). Así mismo, pudimos separar las diferentes intensidades de la emisión del fluorocromo (Fig 8). Sin embargo, a pesar de que la resolución de las imágenes obtenidas con fue mucho mayor con el microscopio láser confocal, no encontramos incremento en el rendimiento diagnóstico de la técnica; el diagnóstico de GN membranosa fue realizado con la microscopía de fluorescencia convencional sin grandes dificultades. Zoom Figura 1 Microfotografías tomadas con fluorescencia convencional (A) y microscopía láser confocal (B)para IgG. Zoom Figura 2 Vista de los depósitos granulares de IgG a mayor aumento (300x). Zoom Figura 3 Detalles a mayor aumento de los depósitos granulares arrosariados de IgG. Imagenes captadas con microscopía láser confocal. Zoom Figura 4 Cortes ópticos seriados de un glomérulo completo (IgG, 250x) Zoom Figura 5 Cortes ópticos seriados de un asa lesionada. Con estas imágenes el ordenador es capaz de reconstruir tridimensionalmente la estructura dañada. Zoom Figura 6 Fotogramas de la proyección animada de la reconstrucción tridimensional del asa representado en la figura 5. (IgG, 650x) Zoom Figura 7 Reconstrucción tridimensional de un asa dañada. Para la visión de esta imagen es necesario el empleo de gafas de visión estereoscópica. (Puede emplearse un filtro rojo en el ojo derecho y un filtro verde en el izquierdo). Zoom Figura 8 Luz emitida por el fluorocromo excitado, separada por intensidades. Figura 9 Principios ópticos de la microscopía láser confocal.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión La microscopía láser confocal fue concebida teóricamente en el año 1953, aunque su aplicación practica no ha tenido lugar hasta los últimos 10 años (1). Actualmente es la técnica de elección para investigación biológica, análisis químico variados, y análisis de materiales. Esta técnica supone la fusión de tecnologías procedentes de diferentes campos: microscopía, tecnología láser, óptica, video, electrónica y aplicaciones informáticas. La microscopía láser confocal permite obtener secciones ópticas de las muestras. Al contrario que los sistemas computerizados de manejo de imágenes, donde se manipulan imágenes ópticas convencionales, el microscopio láser confocal obtiene las reconstrucciones de secciones conseguidas mediante procedimientos ópticos. El microscopio láser confocal detecta las estructuras mediante la adquisición de las imágenes de planos focales (secciones ópticas), obviando la luz emitida por la muestra fuera de foco. Con el fin de obtener secciones ópticas, la iluminación de la muestra necesita ser extremadamente puntual, enfocando un haz de luz en el seno del espécimen (punto focal). El diámetro de ese haz ha de ser lo más pequeño posible, y estará limitado por la difracción de la luz empleada. En estos microscopios se emplea el láser, ya que supone una fuente luminosa con suficiente intensidad y con escasa difracción. Las técnicas empleadas son fundamentalmente la fluorescencia y en menor medida la luz reflejada. El haz de láser excita la muestra moviéndose rápidamente por toda su extensión. Este movimiento se consigue gracias a la existencia de espejos que modulan la dirección del láser, controlados por el ordenador del sistema. Una vez excitado, el fluorocromo empleado emite una luz con una determinada longitud de onda. La luz emitida es separada espectralmente por fotomultiplicadores (fig.9), que además sirven como sensores de luz. Gracias a ellos, el sistema de escaneo del microscopio podrá recoger la luz por intervalos de longitud de onda que nosotros elijamos, pudiendo capturar simultáneamente la emisión de tantos fluorocromos distintos como fotomultiplicadores tenga nuestro aparato. Tras la captura de la primera imagen en dos dimensiones, el ordenador capturará la siguiente imagen, correspondiente al siguiente plano focal, y así sucesivamente. De esta forma se conseguirán series de imágenes consecutivas de una muestra, en formato digital, como si se tratase de rebanadas de una barra de pan. Toda esa cantidad de datos podrá ser procesada con el fin de obtener reconstrucciones tridimensionales, de forma semejante a como se realiza con los estudios de resonancia magnética nuclear, o medidas temporales. La microscopía láser confocal se emplea con frecuencia en la actualidad en investigación básica (2,3). En el campo de la biomedicina, actualmente se utiliza en dermatología y oftalmología clínica (4,5,6). En anatomía patológica, esta técnica posee pocas aplicaciones, fuera de lo que es investigación y docencia (3,7,8,9). En este trabajo hemos comprobado que la microscopía láser confocal puede ser empleada para el estudio de inmunofluorescencia de biopsias renales. Entre sus ventajas destacan la mayor resolución de sus imágenes, la posibilidad de reconstruir estructuras anatómicas y patrones lesionales tridimensionalmente, la capacidad de cuantificar la señal emitida por el fluorocromo y la posibilidad de estudiar colocalización de proteínas si se emplean tinciones de doble marcaje. Entre sus inconvenientes destacan el que no aporta mayor especificidad ni sensibilidad diagnóstica a la microscopía de fluorescencia habitual. Además, su alto coste prácticamente la descarta como método de diagnóstico rutinario. En resumen, la microscopía láser confocal supone una técnica novedosa con interesantes posibilidades en el campo de la investigación y la docencia, pero que no aporta mejoras significativas en el campo de la nefropatología asistencial.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Bibliografia 1.- Onetti Muda A. Confocal laser scanning microscopy. Adv Clin Path. 2000;4:235-9.. 2.- Tatton NA, Maclean-Fraser A, Tatton WG, Perl DP, Olanow CW. A fluorescent double-labeling method to detect and confirm apoptotic nuclei in Parkinson's disease. Ann Neurol. 1998;44:42-8. 3.- Smith GJ, Bagnell CR, Bakewell WE, Black KA, Bouldin TW, Earnhardt TS, Hook GE, Pryzwansky KB. Application of confocal scanning laser microscopy in experimental pathology. J Electron Microsc Tech. 1991;18:38-49. 4.- Petroll WM, Cavanagh HD, Jester JV. Clinical confocal microscopy. Curr Opin Ophthalmol. 1998;9:59-65. 5.- Selkin B, Rajadhyaksha M, Gonzalez S, Langley RG. In vivo confocal microscopy in dermatology. Dermatol Clin. 200;19:369-77 6.- Fink-Puches R, Hofmann-Wellenhof R, Smolle J, Kerl H. Confocal laser scanning microscopy: a new optical microscopic technique for applications in pathology and dermatology. J Cutan Pathol. 1995;22:252-9. 7.- Kouri JB, Arguello C, Luna J, Mena R. Use of microscopical techniques in the study of human chondrocytes from osteoarthritic cartilage: an overview. Microsc Res Tech. 19981;40:22-36. 8.- Salisbury JR. Three-dimensional reconstruction in microscopical morphology. Histol Histopathol. 1994;9:773-80. 9.- Dunn K, Bacallao R. Optical methods in renal research. Semin Nephrol. 1998;18:122-37.