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Página Principal Comunicaciones	ALTERACIONES CITO-HISTOPATOLÓGICAS INDUCIDAS POR UNA NUEVA TOXINA DE Enterobacter cloacae Dra María Gabriela Paraje * , Lic Paola del Carmen Battán * , Dra Inés Albesa * y Dr Ernesto Hliba ** *Departamento de Farmacia **Departamento de Bioquímica Facultad de Ciencias Químicas Universidad Nacional de Córdoba C/ Haya de la Torre y Medina Allende Ciudad Universitaria Córdoba 5000 Córdoba Argentina
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen INTRODUCCIÓN: Se estudió una cepa de Enterobacter cloacae de origen clínico, purificando una toxina con dos formas proteicas: una monomérica y otra polimérica, no pudiendo eliminar totalmente el lipopolisacárido (LPS) unido a la toxina nativa. Ambas formas produjeron un rápido aumento de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en neutrófilos humanos, ocasionando incremento de apoptosis. Altas concentraciones causaron la muerte de los fagocitos por la formación de poros en la membrana celular. OBJETIVOS: Investigar por distintas técnicas de biología molecular las características de una nueva toxina de E.cloacae y comprobar la capacidad histocitotóxica. MATERIALES Y METODOS: Se inyectó subcutáneamente la citotoxina bacteriana en ratas Wistar. Al primer y séptimo días los animales fueron sacrificados y el efecto tóxico fue estudiado histopatológicamente. Se extrajo parte del LPS y se inoculó la toxina remanente en otro lote de animales, realizándose los mismos estudios. RESULTADOS: Las toxinas monomérica y polimérica inoculadas en ratas generaron, a las 24hs, alteraciones vasculares y un cuadro de reacción inflamatoria aguda. A los 7 días las lesiones fueron más significativas en el sitio de inoculación del polímero, que histopatológicamente consistió en un proceso inflamatorio más destacado con sectores necróticos, restos celulares e inicios de fibrosis. Cuando se ensayó la toxina sin LPS, fueron más evidentes los daños tisulares. CONCLUSIONES: Esta nueva toxina podría contribuir a la patogénesis de los procesos infecciosos de E.cloacae, debido a la generación de apoptosis en macrófagos, el daño a otras células por la liberación de ROS en tejidos con infiltrados leucocitarios. La existencia de anemia en ciertas infecciones a E.cloacae se explicaría por la susceptibilidad de los eritrocitos observada en los vasos sanguíneos, comprobando que esta nueva toxina es un factor de virulencia hemolítico, leuco y citotóxico, asociada a infecciones nosocomiales en áreas de cuidados intensivos, reumatología y urología.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción La palabra toxina proviene del latín toxicus que significa “veneno”. Este término fue utilizado por primera vez en la descripción de una “sustancia nociva”, que Roux y Yersin (1888) precipitaron del cultivo de Corynebacterium diphtheriae. Desde entonces los especialistas en el tema han definido estas sustancias de diferentes formas, por ejemplo Madigan y colaboradores (1) las llamaron “sustancias microbianas capaces de inducir daño en el huésped”. Atals en forma más descriptiva, dijo que eran “productos o sustancias orgánicas de origen microbiano que son perjudiciales o letales para células, cultivos celulares u organismos” (2). Una definición clásica las describe como “productos del metabolismo microbiano capaces de causar la disolución física de células de mamíferos u otro tipo "in vitro" (3). Los textos de Microbiología Clínica las definen, desde el punto de vista de las infecciones, en base a la patogenicidad producida por los microorganismos en los seres vivos y el daño que generan, como “componentes o productos de microorganismos los cuales originan e introducen cambios en el animal huésped pudiendo generar enfermedades sintomáticas normalmente asociadas con infecciones” (4). Podríamos concluir definiendo a las toxinas bacterianas como importantes factores de virulencia, que pueden dañar las células del huésped o interferir con los mecanismos de defensa por diversos mecanismos de acción. Las toxinas, así como otros factores de virulencia, representan sofisticados mecanismos de adaptación que desarrollan los microorganismos, mediante los cuales pueden combatir las defensas del huésped y tener acceso a los nutrientes que se encuentran en los tejidos, utilizándolos en su desarrollo. Los miembros de la familia de toxinas Repeats ToXin (RTX)son un grupo de toxinas producidas por bacterias Gram negativas de distintas especies. Son citolisinas formadoras de poros, con gran variedad de células y huésped blanco de acción. El prototipo de esta familia es la a hemolisina de Escherichia coli (HlyA), aislada de cepas hemolíticas provenientes de infecciones extraintestinales. Las bacterias integrantes de la familia Enterobacteriaceae son las responsables de la mayor parte de las infecciones nosocomiales que se observan en la actualidad, pero el rol que desempeñan las toxinas en estas enfermedades todavía no está bien establecido para géneros como Enterobacter. Por tal motivo, en este trabajo se estudió una cepa de Enterobacter cloacae de origen clínico el Hospital Tránsito Cáceres de Allende de la ciudad de Córdoba, Argentina. Durante la purificación de la toxina, la combinación de técnicas cromatográficas y SDS-PAGE mostraron dos formas proteicas de distintos tamaños moleculares: un monómero (13,3 kDa) y polipéptidos con diferentes pesos moleculares (27 kDa, 42 kDa y 66 kDa). No se pudo eliminar todo el LPS unido a la toxina nativa, pero se logró reducir su presencia hasta un valor que no se considera interferente, similar a lo que se aceptó en la purificación de otros integrantes de la familia RTX(5). La reacción cruzada entre HlyA de E.coli y la toxina de E.cloacae observada por inmunoblotting indicaría una importante semejanza entre ambas lisinas, pero existen diferencisa en los pesos moleculares y secuencias de aminoácidos. Estudios de actividad hemolítica sugirieron que la toxina se une en forma monomérica a la membrana de los eritrocitos de caballo, carnero, conejo y humano. Se requirió una oligomerización de los monómeros para lisar las células, mostrando dependencia con la temperatura. El daño de membrana de los eritrocitos humanos fue estimado en 3,6 nm, mediante ensayos con protectores osmóticos realizados tanto con monómero como con polímero de 66 kDa. Por ME se observó ausencia de alteraciones ultraestructurales en membrana de eritrocitos al igual que con la hemolisina de E.coli. Además fue necesaria la presencia de un agente oxidante como 2-ME para manifestar la actividad hemolítica (6). En determinaciones efectuadas por Quimioluminiscencia y por la reacción de Azul de Tetrazolio, tanto el monómero como el polímero de la toxina de E.cloacae a baja concentración, produjeron un rápido incremento en la generación de ROS especies reactivas del oxígeno! en neutrófilos humanos, tiempo y dosis dependiente. A concentraciones mayores produjeron la muerte de fagocitos, debido a la acción lítica de la toxina (7). Por CF se evidenció una unión diferencial con leucocitos respecto a eritrocitos, así como también se apreció distinto grado de unión entre leucocitos (8). El aumento de ROS produjo estrés oxidativo e indujo muerte por apoptosis a concentraciones sublíticas de la toxina, siendo la endocitosis el mecanismo de ingreso celular detectado. La muerte por apoptosis fue demostrada por electroforesis del DNA genómico y por ME de leucocitos, observándose las características propias de este tipo de muerte. Sin embargo, a altas concentraciones de toxina, los poros originados en la superficie celular por la polimerización condujeron a la lisis. Se posible proponer entonces que la modulación de radicales libres por parte de la toxina podría ser uno de los factores involucrados en la patogénesis de la infección bacteriana, produciendo un incremento de la liberación de ROS que daña la célula (9,10). Estudios inmunológicos indicaron que la toxina de E.cloacae estimuló la producción de anticuerpos específicos en cortos períodos de tiempo en conejos inoculados con el monómero. Los antisueros obtenidos pudieron inhibir: el efecto hemolítico, la generación de radicales del oxígeno en leucocitos y la muerte por apoptosis de las células sensibles a la toxina. La importancia de la citotoxina como posible factor de virulencia in vivo, también fue demostrada en los ensayos en peritoneo de rata, los que reforzaron el concepto que leucocitos y macrófagos pueden sufrir en el organismo las consecuencias del estrés oxidativo, con descontrol de su metabolismo y posterior lisis en presencia de cepas hemolíticas de E.cloacae. Una variante no hemolítica (C4) lograda en el laboratorio, cuando fue inoculada intraperitonealmente incrementó la afluencia de macrófagos peritoneales respecto a los controles no tratados y los inyectados con la cepa hemolítica (C1), habiendo generado ésta última muerte de leucocitos en la cavidad peritoneal (11). Dado que la toxina de E.cloacae, no ha sido descripta ni estudiada por otros autores, resulta necesario investigar los aspectos que hacen a su actividad y evaluar la importancia de la misma en la patología infecciosa humana. OBJETIVOS Es necesario, ante una nueva toxina como la de E.cloacae, investigar por distintas técnicas de biología molecular las características de esta nueva toxina y comprobar la capacidad histocitotóxica sobre diferentes tejidos o células, para evaluar las consecuencias que pueden tener en el huésped. Rata o conejo suelen ser modelos de estudio adecuados y la inoculación experimental representa la forma más efectiva de apreciar los efectos sobre diversos órganos o tejidos. La vía de aplicación de la toxina constituye una forma de canalizar la acción, de modo que inyectando en forma subcutánea, se pueden analizar las alteraciones posibles provocadas en tejido muscular, celular subcutáneo o a nivel de epidermis en la zona de inoculación. Además mediante la vía intraperitoneal es factible detectar la acción sobre macrófagos "in vivo". Es conveniente remarcar que recién cuando se pueda clarificar él o los tejidos en que ejerce la acción nociva una toxina, es posible ensayar formas o procedimientos para neutralizar el daño. La frecuente asociación del fenotipo hemolítico y la patogenia ha llevado a la conclusión de que las hemolisinas bacterianas son importantes factores de virulencia, pero su contribución en las distintas infecciones está pobremente definida en la mayoría de los casos. El rol de agresividad de la hemolisina de E.cloacae no está dilucidado, ya que esta lisina ha sido descripta recientemente, de modo que es necesario una valoración conjunta de diferentes centros nosocomiales y una investigación a nivel básico para poder evaluar con bases moleculares las observaciones que derivan de problemas infecciosos. Conocer este mecanismo puede ser útil para desarrollar tratamientos que contrarresten la acción de toxinas, interfiriendo en la endocitosis e impidiendo el daño causado por algunas de ellas.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos La toxicidad in vivo de la citolisina de E.cloacae fue estudiada por inyecciones subcutáneas de 1 mL de toxina en estado polimérico (450 mg/mL) y 1mL en estado monomérico (400 mg/mL), en seis ratas Wistar albinas (200-400 gramos). Después de 24 h y 7 días los animales fueron sacrificados y el efecto tóxico fue estudiado. Se realizaron estudios histológicos de rutina del material extraído. Para discernir el papel que desempeña el LPS en la familia de las toxinas RTX se procedió a extraer el LPS presente en la toxina e inocularlo a los animales para observar el grado de toxicidad del mismo, con ello se quiso descartar que pudiese ser el responsable de las lesiones observadas anteriormente, a pesar de que se demostró que el LPS se encuentra a bajas concentraciones en las muestras de toxina después del proceso de purificación. El LPS extraído fue inyectado subcutáneamete en ratas, haciéndoles disección a los 7 días. Por otro lado se inoculó, en las mismas condiciones descriptas, la toxina obtenida después de la extracción del LPS. Es decir que el LPS extraído y la toxina purificada fueron inyectados separadamente, realizándose los estudios histológicos de los animales inoculados. Para extraer el LPS presente en la toxina se utilizó una modificación del tradicional método para aislar LPS de bacterias Gram negativas, basado en la extracción con fenol acuoso caliente (Método de Westphal) quedando el LPS en la fase acuosa . Por otra parte, la cepa productora de la citotoxina bacteriana (1x1.000.000 bacterias) fue inyectada en dos ratas Wistar albinas, con el objetivo de reaislarla y analizar el efecto que producía en los animales. A las 24 horas también por punción cardíaca fue obtenida una muestra de sangre, cultivada en medios nutritivos, estudiándose la cepa que desarrolló en medios selectivos y diferenciales (EMB), efectuándose finalmente la tipificación de la misma.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados Observaciones Macroscópicas: Cuando el monómero y el polímero (0,4 mg/mL) fueron inoculados en ratas para conocer el efecto in vivo y después de 24 horas de la inyección subcutánea se sacrificaron los animales, se observaron alteraciones vasculares con signos de inflamación en la zona de inyección de la toxina polimérica y monomérica. Fotografía 1. Otro grupo de animales fue sacrificado a los 7 días de la inoculación y se observó una marcada reacción inflamatoria con vasos dilatados y aspecto necrótico que producían adherencia entre piel y músculo, capilares sanguíneos dilatados y congestivos. Las alteraciones fueron mayores en los lugares en que se inyectó el polímero y aumentó notablemente al daño observado a las 24 h. Fotografía 2. En la fotografía 3 se comparan tres animales donde se observan las lesiones observadas en los lugares de inoculación a los 7 días de la inoculación del LPS extraído de la toxina, el remanente de la toxina de esta extracción y la toxina purificada. Observaciones Microscópicas: El estudio histológico de las muestras a las 24 h de la inoculación mostró signos de inflamación, producidos en forma notablemente mayor con el polímero que con el monómero. Si bien hubo efecto tanto en tejido muscular como en tejido subcutáneo, el primero fue el más afectado con ambas formas de la toxina. Se observó una fuerte reacción inflamatoria característica de un proceso agudo, con predominio de PMN acompañados por macrófagos y células mononucleares y sectores con exudado fibrinoso, con abundantes piocitos. Los capilares sanguíneos se mostraron congestivos y dilatados con eritrocitos alterados y franca hemólisis. Fotografías 4 a 9. En el lote sacrificado a los 7 días de la inoculación se observó el infiltrado inflamatorio invadiendo el músculo, pérdida de miofibrillas y mioglobina y marcadas alteraciones de las células musculares que determinaban necrosis de los mismos. Predominaron las células mononucleadas y macrófagos fibroblastos. Los PMN se observaron alterados, quedando restos de núcleos y gránulos (detritus celulares). Hubo indicios de formación de tejido de granulación y neovascularización, conociéndose que la presencia de nuevos vasos conduce a la remoción de necrosis y el reemplazo por fibrosis. La reacción inflamatoria fue tan significativa, que produjo reducción en el espesor de la capa muscular, ya que el infiltrado avanzó hacia el músculo, evidenciando focos necróticos y células musculares que parecen células gigantes ya que los miofilamentos se reducen notablemente, quedando solo restos de ellos, rodeados por núcleos subsarcolemáticos. Estas alteraciones fueron superiores en los lugares en que se inyectó el polímero. Fotografías 10 a 19. En las fotografías 20 y 21 se observan muestras controles. Los animales que fueron inoculados con la cepa bacteriana productora de la toxina, mostraron aspecto de enfermos, pelaje opaco y tieso y abdomen inflamado con una peritonitis marcada. El material obtenido de peritoneo fue muy purulento, con presencia de hematíes, lo que indica permeabilidad de los vasos del mesenterio y mucosa producida posiblemente por una septicemia. La bacteria obtenida del material de punción cardiaca fue tipificada como E.cloacae. Zoom Foto 1 Inyección subcutánea de la toxina monomérica (M) y polimérica (P) (24 h). Zoom Foto 2 Inyección subcutánea de la toxina monomérica (M) y polimérica (P) (7 días). Zoom Foto 3 Inyección subcutánea del LPS extraído de la toxina (1), de la toxina monomérica y polimérica (2) y con la toxina remanente de la extracción (3) (7 días). Zoom Foto 4 Toxina monomérica en tejido subcutáneo (24 hs): Piel revestida de epitelio plano estratificado queratinizado, dermis con anexos pilo-sebáceos y glándulas sudoríparas e hipodermis. La zona próxima al músculo, por debajo de la misma, presenta un discreto infiltrado inflamatorio. (50 X) Zoom Foto 5 Toxina monomérica en tejido muscular y subcutáneo (24 hs): Tejido muscular esquelético. En el tejido celular subcutáneo hay capilares sanguíneos congestivos y dilatados. Escasos leucocitos mononucleares distribuidos focalmente. (1000 X) Zoom Foto 6 Toxina polimérica en tejido subcutáneo (24 hs): En dermis e hipodermis, se observó un trayecto fistuloso rodeado de tejido de granulación compuesto por un infiltrado inflamatorio de PMN, con vasos sanguíneos congestivos, dilatados y hemólisis dentro de los mismos. Las células musculares presentan discretas alteraciones e infiltrado leve. (100 X) Zoom Foto 7 Toxina polimérica en tejido subcutáneo (24 hs): A mayor aumento puede observarse las características del infiltrado inflamatorio. Los vasos sanguíneos congestivos y dilatados, los eritrocitos en se ven lisados. (400 X) Zoom Foto 8 Toxina polimérica en tejido muscular (24 hs): Próximo al tejido muscular esquelético mostró una marcada reacción inflamatoria, constituida por infiltrado inflamatorio de leucocitos PMN neutrófilos, piocitos y posibles cuerpos apoptóticos. Los vasos sanguíneos dilatados y en sectores exudado fibrinoso con abundantes piocitos. En las zonas próximas al infiltrado se observó separación de miofibrillas con pérdida de coloración y estructura de fibras musculares. Invasión de infiltrado de piocitos próximo al músculo. (400 X) Zoom Foto 9 Toxina polimérica en tejido muscular (24 hs): Infiltrado de tejido conectivo perimuscular, piocitos pero con predominio de PMN acompañado de macrófagos y células mononucleares. Los eritrocitos en los vasos se ven lisados. (1000 X) Zoom Foto 10 Toxina monomérica en tejido subcutáneo (7 días): Se observa mayor daño en las células musculares al observado en piel y músculo a las 24 hs observados en la figura 1. Los eritrocitos en los vasos se encontraron totalmente lisados. (400 X) Zoom Foto 11 Toxina monomérica en tejido subcutáneo (7 días): Marcado infiltrado inflamatorio en la hipodermis con vasos congestivos y hemólisis comprometiendo al tejido muscular. (50X) Zoom Foto 12 Toxina polimérica en tejido subcutáneo (7 días): Daño mayor al observado en piel y músculo a las 24 hs, con reducción de la capa muscular y abundante infiltrado inflamatorio. (50X) Zoom Foto 13 Toxina polimérica en tejido subcutáneo (7 días) (1000 X) Zoom Foto 14 Toxina polimérica en tejido muscular (7 días): Detalle de las modificaciones ocasionadas en las células musculares y el infiltrado que interactúan con las mismas. (400X) Zoom Foto 15 Toxina polimérica en tejido muscular (7 días): A mayor magnificación se puede apreciar detalles de los capilares, algunos de neo-formación con infiltrado PMN, macrófagos y fibroblasotos. (1000X) Zoom Foto 16 Toxina después de la extracción del LPS (7 días): Desorganización de tejido con paulatina invasión del infiltrado inflamatorio hacia el tejido muscular que produce alteraciones más severas a medida que es infiltrado por el proceso inflamatorio. El infiltrado invadió y destruye el músculo. Se observaron PMN, con predominio de mononucleares y macrófagos. Parte de las células musculares quedan reducidas, tomando aspecto de células gigantes, cuyos núcleos subsarcolemáticos rodean restos de mioglobina y otras con necrosis. (400X) Zoom Foto 17 Toxina después de la extracción del LPS (7 días): (100X) Zoom Foto 18 Toxina después de la extracción del LPS (7 días): (1000X) Zoom Foto 19 LPS extraído de la toxina monomérica (7 días): El músculo se mantuvo como el control, con las estriaciones propias del músculo, con escaso y focal infiltrado inflamatorio. (100 X) Zoom Foto 20 Muestra control (24 h): Las secciones histológicas de hipodermis con tejido muscular esquelético sin alteraciones de significancia. (50 X) Zoom Foto 21 Tejido muscular esquelético en sección transversal sin particularidades. (400X)
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión Lee y colaboradores (13) describieron que, cultivos primarios de condrocitos humanos fueron susceptibles a pequeños inóculos de Staphylococcus aureus capaces de inducir apoptosis. Además, es sabido que después de una infección en articulaciones existe una hipocelularidad, la que ha sido atribuida a un efecto citotóxico residual que puede causar necrosis. En relación a esto, es necesario mencionar que la cepa de E.cloacae estudiada fue aislada de una infección de articulación con abundante leucocitos. Dada la severidad del proceso, interesó encontrar alguna forma terapéutica que pudiese atenuar o prevenirlo, en tal sentido el desarrollo de una inmunoprofilaxis pasiva, o el uso de una vacuna, podría constituir una contribución para el tratamiento de estos enfermos. Como se expresó anteriormente, la investigación del daño generado por la toxina debe ser profundizado para comprender el mecanismo de acción de la misma. En este sentido se hicieron algunos adelantos, que podemos resumir de la siguiente manera: cuando la toxina en forma monomérica o polimérica fue inoculada en ratas para conocer su efecto in vivo, fueron detectadas tempranamente alteraciones vasculares a las 24 h. El cuadro de reacción inflamatoria observado con infiltrado de PMN, presencia de piocitos y vasodilatación correspondió a un proceso agudo. Este efecto incrementó durante los 7 días de observación, con importantes alteraciones tisulares y necrosis. Las lesiones dérmicas y musculares fueron más intensas en los sitios donde fue inoculado el polímero que donde se inyectó el monómero; siendo el tejido muscular el más afectado. A los 7 días el cuadro inflamatorio fue más significativo, con sectores necróticos, presencia de restos celulares e indicios de fibrosis post-necrótica. Cabe destacar que inflamación, infiltración leucocitaria y finalmente necrosis, son pasos frecuentemente asociados con la injuria tisular. En la bibliografía se encuentran citados algunos agentes que lesionan membranas, incluyendo bacterias, sus hemolisinas y leucotoxinas, las cuales inducen rápido daño celular con necrosis (14). El infiltrado de leucocitos observado es importante para comprender la patogenicidad de E.cloacae, ya que el infiltrado de tejidos por estas células puede dar origen a la liberación de ROS leucocitario en presencia de la toxina, conduciendo al daño de los tejidos circundantes. Es necesario destacar que esta consecuencia de la infección podría estar implicada en la patogénesis de diversas enfermedades. Los resultados obtenidos indican la importancia de la toxina en los procesos infecciosos por E.cloacae, debido a la generación de apoptosis en macrófagos, el daño a otras células por la liberación de radicales del oxígeno en tejidos con infiltrados de leucocitos y la acción hemolítica observada en los vasos sanguíneos. Existen antecedentes que muestran que la perfusión en pulmón, de cepas de Pasteurella haemolytica productoras de la leucotoxina, produjo histamina y otras sustancia como respuesta a una serie de estímulos secundarios, mientras que el LPS disminuyó estos efectos (15) mostrando un efecto antagónico entre la toxina y el LPS. Similares resultados fueron encontrados en nuestro laboratorio, ya que cuando se extrajo el LPS de la toxina fueron más evidentes los daños tisulares obtenidos. Hubo menos focos necróticos cuando se utilizó la toxina con restos de LPS, sugiriendo que los efectos encontrados no fueron causados por el LPS sino por la toxina. Sin embargo existen otros antecedentes que ciertas hemolisinas podrían actuar cooperativamente con el LPS; encontramos ejemplos que perfusiones en pulmón de conejo con pequeñas cantidades de Salmonella abortus con el LPS potenciaron la liberación de tromboxano y la hipertensión pulmonar comparado con otras en donde se había extraído el LPS (16). En conclusión, los datos presentados pueden ayudar a dilucidar el mecanismo de acción de la toxina de E.cloacae, que mostró un amplio espectro de células sensible. La toxina monomérica y polimérica fueron activas contra eritrocitos de distintas especies, leucocitos humanos, conejo y caballo, produjeron daño en tejido dérmico y muscular de ratas. Es posible atribuir a esta toxina un rol importante en la injuria al huésped, teniendo en consideración que la virulencia de las bacterias es una propiedad multifactorial, la cual varía de cepa en cepa de la misma especie. Los ensayos in vivo evidenciaron necrosis de tejidos, atribuibles a las especies reactivas del oxígeno producidas inter y extra celular por la presencia de infiltrado leucocitario que lesiona músculo y tejido. Las células sanguíneas mostraron susceptibilidad a la citotoxina de E.cloacae, lo que explica la existencia de anemia en ciertas infecciones a esta bacteria, agravada por el daño manifiesto sobre leucocitos, que afecta la barrera defensiva del hombre y otros mamíferos. Podemos concluir que la toxina es un factor de virulencia hemolítico, leuco y citotóxico, con importante rol en la patogénesis de E.cloacae asociada a infecciones nosocomiales en áreas de cuidados intensivos, reumatología y urología.
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