Se utilizaron cobayos albinos hembras de 250-400 g de peso. Tras dislocación cervical y posterior sección del paquete vásculo-nervioso del cuello y de la columna vertebral, se accedió a la masa intestinal por disección de la piel y de la musculatura de la pared anterior del abdomen. Se extrajo un segmento de íleon de unos 2 cm, después de despreciar los 10 cm distales correspondientes a la unión íleo-cecal y se sumergió en solución de Krebs modificada (Krebs y Henseleit, 1932) (
4) con nicardipina y hioscina (ambos, 1 microM), sin perder en ningún momento la orientación oral-anal.
Se realizó disección del segmento sobre la base de silicona de una placa Petri: se abrió el segmento longitudinalmente por la línea mesentérica y se separaron las capas de mucosa, submucosa y musculatura circular, dejando el plexo mientérico unido a la capa de musculatura longitudinal.
La preparación así obtenida se fijó a una cámara de registro electrofisiológico mediante hilos de tungsteno de 50 micras. Se perfundió continuamente con Krebs oxigenado con gas carbógeno a temperatura de 37ºC. Mediante microscopía invertida se visualizaron los ganglios.
Para el acceso a neuronas individuales se empleó la técnica de registro intracellular descrita con detalle en un trabajo previo (Abalo y col. 2000) (
1). Mediante un micromanipulador se situó un microelectrodo de borosilicato de resistencia 150-250 Mohmios cuya punta se había rellenado previamente con
neurobiotina. Se realizó el empale de las neuronas al azar y cada una se clasificó desde el punto de vista electrofisiológico según criterios ampliamente establecidos (Bornstein y col. 1994) (
2). En ningún ganglio se empaló más de una célula. Mediante pulsos eléctricos depolarizantes largos (200-500 ms) se inyectó la
solución de neurobiotina en el cuerpo celular al efecto de rellenarla para su posterior evaluación morfológica.
Posteriormente, se fijó la preparación en solución de
Zamboni y se mantuvo a –4ºC 24 h. Tras varios lavados con dimetilsulfóxido, primero, y solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubó con estreptavidina conjugada con Alexafluor 488 durante 2h en agitación a temperatura ambiente. Se deshidrató con glicerol tamponado con fosfato de concentraciones crecientes (50, 75 y 100%) y se montó para su visualización microscópica.