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Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.

Eduardo García Poblete (1) , Raquel Abalo Delgado (2) , Ernesto Moro Rodríguez (1) , Héctor Fernández García (1) , Mª Isabel Martín Fontelles (2) , Antonio Rivera López-Tello (2) y Mª Soledad García Gómez de las Heras (3)

Universidad Rey Juan Carlos.
Facultad de Ciencias de la Salud.
(1) Área de Histología.
(2) Área de Farmacología.
(3) Área de Anatomía.
Alcorcón (Madrid).

España
 Resumen
Introducción: El sistema nervioso entérico está constituido por ganglios y haces comunicantes de fibras nerviosas formando extensos plexos que se extienden desde el esófago inferior hasta el esfínter anal y que se disponen principalmente en dos agrupaciones neuronales localizadas, una a nivel submucoso (plexo submucoso de Meissner) y otra, la más desarrollada, entre las capas musculares longitudinal y circular (plexo de Auerbach). En ambas localizaciones se han identificado neuronas con actividades sensitivas y motoras, así como interneuronas. Objetivo: En el presente trabajo se ha pretendido reconstruir tridimensionalmente los cuerpos de distintos tipos neuronales presentes en el plexo mientérico de Auerbach: neuronas Dogiel tipo I (motoras e interneuronas) y Dogiel tipo II (sensitivas). Material y Métodos: Se obtuvieron muestras de intestino delgado procedentes de cobayos adultos en los que se realizó una microdisección desde la mucosa hasta la capa muscular circular dejando expuesto el plexo mientérico que descansa sobre la capa muscular longitudinal. A continuación se procedió bajo visión microscópica a la microinyección con neurobiotina. Se identificaron mediante microscopía de fluorescencia la presencia de los cuerpos microinyectados y mediante microscopía confocal (LSM 510 Zeiss®) se procedió a su registro digital, proyección espacial y reconstrucción tridimensional. Resultados: Se han podido identificar y reconstruir 3D los distintos tipos neuronales presentes en los ganglios del plexo mientérico de Auerbach que previamente ya eran conocidos mediante histología convencional y ultraestuctura. Sobre éstas reconstrucciones se ha realizado un estudio morfométrico mediante el programa Image Pro® para establecer sus distintas áreas superficiales y cálculos volumétricos comparando los resultados con trabajos similares como los publicados por Hanani et al (1998) Conclusiones: Los estudios 3D en este campo añaden una visión nueva a la ya conocida de éstos elementos celulares que pudiera ayudar a entender de forma más precisa la disposición espacial del complejo entramado de interconexiones presentes a éste nivel. Los resultados obtenidos en el presente trabajo son concordantes con los hallazgos publicados por autores como los anteriormente mencionados.
 Introducción

El sistema nervioso entérico intrínseco, que gobierna de forma autónoma casi la totalidad de las funciones intestinales, ha sido bien estudiado desde hace tiempo tanto desde aspectos estructurales como fisiológicos.

Éste sistema nervioso está constituido por ganglios y haces comunicantes de fibras nerviosas que forman extensos plexos que se extienden desde el esófago inferior hasta el esfínter anal y que se disponen principalmente en dos agrupaciones neuronales localizadas, una a nivel submucoso (plexo submucoso de Meissner) y otra, la más desarrollada, entre las capas musculares longitudinal y circular (plexo de Auerbach).

En ambas localizaciones se han identificado neuronas con actividades sensoriales y motoras, así como interneuronas.

Estas células son bien conocidas desde los trabajos iniciales con impregnaciones argénticas, seguidos de estudios desde vertientes tanto histoquímicas e inmunohistoquímicas, como farmacológicas, ultraestructural o electrofisiológicas con el objeto de llegar a caracterizar los distintos y complejos “esquemas de conexión” que determinarían los arcos reflejos intrínsicos del tubo digestivo; al tiempo que esclarecer la fisiopatología de algunos procesos todavía insuficientemente conocidos como por ejemplo, entre otros, el megacolon adquirido secundario a estreñimiento crónico.

Objetivo : En el presente trabajo se ha pretendido reconstruir tridimensionalmente los cuerpos de los distintos tipos neuronales presentes en el plexo mientérico de Auerbach: neuronas Dogiel tipo I (motoneuronas e interneuronas); y neuronas Dogiel tipo II (generalmente sensoriales).

 Material y Métodos


Se utilizaron cobayos albinos hembras de 250-400 g de peso. Tras dislocación cervical y posterior sección del paquete vásculo-nervioso del cuello y de la columna vertebral, se accedió a la masa intestinal por disección de la piel y de la musculatura de la pared anterior del abdomen. Se extrajo un segmento de íleon de unos 2 cm, después de despreciar los 10 cm distales correspondientes a la unión íleo-cecal y se sumergió en solución de Krebs modificada (Krebs y Henseleit, 1932) (4) con nicardipina y hioscina (ambos, 1 microM), sin perder en ningún momento la orientación oral-anal.

Se realizó disección del segmento sobre la base de silicona de una placa Petri: se abrió el segmento longitudinalmente por la línea mesentérica y se separaron las capas de mucosa, submucosa y musculatura circular, dejando el plexo mientérico unido a la capa de musculatura longitudinal.

La preparación así obtenida se fijó a una cámara de registro electrofisiológico mediante hilos de tungsteno de 50 micras. Se perfundió continuamente con Krebs oxigenado con gas carbógeno a temperatura de 37ºC. Mediante microscopía invertida se visualizaron los ganglios.

Para el acceso a neuronas individuales se empleó la técnica de registro intracellular descrita con detalle en un trabajo previo (Abalo y col. 2000) (1). Mediante un micromanipulador se situó un microelectrodo de borosilicato de resistencia 150-250 Mohmios cuya punta se había rellenado previamente con neurobiotina.

Se realizó el empale de las neuronas al azar y cada una se clasificó desde el punto de vista electrofisiológico según criterios ampliamente establecidos (Bornstein y col. 1994) (2). En ningún ganglio se empaló más de una célula. Mediante pulsos eléctricos depolarizantes largos (200-500 ms) se inyectó la solución de neurobiotina en el cuerpo celular al efecto de rellenarla para su posterior evaluación morfológica.

Posteriormente, se fijó la preparación en solución de Zamboni y se mantuvo a –4ºC 24 h. Tras varios lavados con dimetilsulfóxido, primero, y solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubó con estreptavidina conjugada con Alexafluor 488 durante 2h en agitación a temperatura ambiente. Se deshidrató con glicerol tamponado con fosfato de concentraciones crecientes (50, 75 y 100%) y se montó para su visualización microscópica.



 Resultados
Recontrucción 3D Neurona de Dogiel I - Figura 1: 3D_1.mpg (397 Kb)
Recontrucción 3D Neurona de Dogiel I - Figura 2: 3D_2.mpg (269 Kb)
Recontrucción 3D Neurona de Dogiel II - Figura 3: 3D_3.mpg (401 Kb)
Recontrucción 3D Neurona de Dogiel II - Figura 4: 3D_4.mpg (689 Kb)
Recontrucción 3D Neurona de Dogiel II - Figura 5: 3D_5.mpg (401 Kb)
Recontrucción 3D Neurona Filamentosa - Figura 6: 3D_6.mpg (472 Kb)


Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Dogiel I
Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Dogiel I
Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Dogiel II
Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Dogiel II
Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Dogiel II
Imagen de Reconstrucción 3D de los cuerpos neuronales del plexo mientérico de Auerbach.Zoom
Neurona Filamentosa
 Bibliografia
1. Abalo R, Pascual D, Goicoechea C y Martin MI. (2000): Blockade by pertussis toxin of the opioid effect on guinea pig ileum. Contractility and electrophysiological neuronal recording. Neurosci Lett 2000 Sep 22;291(3):131-4

2. Bornstein JC, Furness JB y Kunze WAA. (1994): Electrophysiological chracterization of myenteric neurons: how do classification schemes relate? J. Auton. Nerv. Syst. 48: 1-15

3. Hanani M, Ermilov LG, Schmalz PF, Louzon V, Miller SM y Szurszewski JH. (1998): The three-dimensional structure of myenteric neurons in the guinea-pig ileum. J. Auton. Nerv. Syst. 71(1): 1-9

4. Krebs HA y Henseleit KZ. (1932): Untersuchungen über die Harnstoff bidning in Tierxörper. Hoppeseyler’s Z.J. Physiol. Chem. Ithaca 210:33.

NOTA: Esto es un foro médico profesional, que no tiene como objetivo ofrecer consejo médico o de salud. Los mensajes enviados a este foro solicitando estos consejos, no serán atendidos. La información científica ofrecida está refrendada por las referencias y bibliografía correspondientes y de su veracidad son responsables sus autores. La participación en este Congreso es gratuita.

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