| IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA | |
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 Abstract |
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Conclusiones |
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IMÁGENES | |||||
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INTRODUCCIÓN | |
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La Glicoproteína P (Gp-P) es una proteína transmembrana con función transportadora dependiente de energía, que tiene por misión expeler xenobióticos lipofílicos del interior de las células disminuyendo su concentración y evitando que alcance la diana celular. La Gp-P responsable del fenómeno MDR en las células neoplásicas, también se ha identificado en tejidos normales como corteza suprarrenal, túbulo contorneado proximal renal, en precursores linfoides de médula ósea y en linfocitos de sangre periférica, donde se ha detectado ARNm del gen MDR1 aunque en baja expresión (Noonan et al, 1990). La diversidad de formas y técnicas disponibles para abordar el estudio del fenómeno MDR ha propiciado una gran variabilidad en los resultados, tanto inter como intralaboratorio, y ha puesto de manifiesto la necesidad de establecer unas líneas maestras para la detección de la Gp-P y del ARNm del gen MDR1 que permitan obtener resultados más reproducibles. Así, en la reunión de especialistas en el estudio del fenómeno MDR, celebrada en Memphis en 1994 (Beck et al, 1996), se alcanzaron una serie de conclusiones de consenso preliminares para establecer la estandarización de los métodos de estudio del fenómeno de multirresistencia a fármacos, especialmente para la determinación del genotipo (MDR1) y del fenotipo (Gp-P) en muestras clínicas. Estudios multicéntricos posteriores han demostrado la elevada variabilidad que existe en los resultados de la evaluación del fenotipo MDR ligado a Gp-P en las muestras y recomiendan realizar la estandarización de los ensayos mediante la aplicación de las conclusiones de consenso establecidas por Beck y colaboradores (Chevillard et al, 1997). En 1997 Beck y Grogan, desarrollaron con mayor detenimiento las recomendaciones reseñadas de Memphis y abrieron el camino a nuevas reuniones para el estudio del fenómeno MDR y la estandarización de su evaluación (Beck y Grogan, 1997). El objetivo de este trabajo fue determinar si son reproducibles entre laboratorios, los resultados de la valoración de la Gp-P en muestras con baja expresión, como son las células de sangre periférica de individuos sanos, utilizando para ello citometría de flujo e inmunofluorescencia directa. |
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MATERIAL Y MÉTODOS | |
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Muestras Sanguíneas: Las muestras sanguíneas de los individuos sanos se obtuvieron de los donantes de sangre que asistieron al Centro Regional de Transfusión Sanguínea de Granada, tras consentimiento informado para participar en el estudio. La media de la edad de los donantes estudiados fue 32,36 ± 11,02 años, predominando los sujetos comprendidos entre los 18 y 35 años (69.35%). La edad mínima fue 18 y la máxima 65 años. En cuanto a la distribución por sexo, un total de 81 (64,80%) correspondían a hombres y 44 (35,2%) a mujeres (Gráfico 4.1). En todos los casos, se realizó la determinación de los niveles de Gp-P en las células nucleadas por inmunofluorescencia directa, mediante citometría de flujo. Líneas Celulares: En este trabajo se utilizaron como controles negativo y positivo de la prueba para la detección de la Gp-P, las líneas celulares de fibroblastos de ratón, NIH-3T3-G185 transfectada con el gen MDR1 humano y la parental correspondiente NIH-3T3. Ambas líneas celulares fueron cedidas a nuestro laboratorio en el año 1997 por el Dr. Cardelli, perteneciente al laboratorio de biología molecular del National Institute of Health (NIH) de Besthesda, Estados Unidos. Fueron mantenidas según los procedimientos estándar de cultivos celulares y posteriormente criopreservadas en DMSO (Merck) adicionado al 10% (v/v) sobre el medio de cultivo DMEM y enriquecido con un 5-10% de suero bovino fetal (SBF) (O’Valle et al, 1993) Inmunofluorescencia Directa y Citometría de Flujo Metodología: La determinación de la Gp-P se hizo sobre 100 µL de sangre total según el siguiente procedimiento técnico:
Estudio Estadístico:
El análisis estadístico de los resultados se realizó con el programa informático RSIGMA BABEL (Honorus Hardware), asumiendo como máximo un error alfa del 5% (p<0.05) en todas las pruebas realizadas. La normalidad de las variables se valoró mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. El análisis comparativo de la distribución de medias aritméticas de variables normales se realizó mediante el test de Student (t de Student). La relación entre variables normales se estableció mediante regresión lineal y determinación de los coeficientes de correlación lineales de Pearson y Spearman.
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RESULTADOS | |
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Se estudiaron un total de 125 muestras de sangre periférica de donantes de sangre, procedentes del Centro Regional de Transfusión Sanguínea de Granada, una vez comprobada la negatividad para marcadores virales anti-VHC, anti-VIH 1 + 2 y antígeno VHB. En la Tabla 1, se presentan los resultados del % POS y la IMFE de la Gp-P por citometría de flujo, en dos citómetros diferentes: Citómetro de Flujo 1 (CF1) (Departamento de Anatomía Patológica) y Citómetro de flujo 2 (CF2) (Centro Regional de Transfusión Sanguínea de Granada), observándose que para el porcentaje de células positivas los valores eran semejantes en ambos citómetros de flujo (t de Student, NS) (Gráfico 1) mientras que para la incorporación media de fluorescencia específica (IMFE), los detectados por el CF2 fueron más elevados que los del CF1 (t de Student, p<0.001) (Gráfico 2). El análisis estadístico con el test de correlación de Pearson mostró que los valores del porcentaje de células positivas y la IMFE para la Gp-P, en las subpoblaciones celulares de sangre periférica de los individuos sanos, los cuales fueron evaluados en dos citómetros de flujo, mantuvieron una buena correlación entre sí. En la Tabla 2 puede apreciarse que para el % POS la mejor correlación observada fue en los linfocitos (r=0.93), mientras que para la IMFE la correlación más alta se observó en los granulocitos (r=0.94) (Tabla 3). |
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DISCUSIÓN | |
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Uno de los principales problemas que se encuentran al valorar la expresión del gen MDR1 y la Gp-P son las diferencias en las maneras de valorar los resultados por los diferentes autores. También existe una gran variedad de factores que influyen en la detección de la Gp-P en las diferentes muestras clínicas, como son la baja expresión que es el caso de los leucocitos de sangre periférica; los métodos de preparación, fijación y análisis de la muestra, la utilización de anticuerpos con especificidad variable y diferentes epítopos de reconocimiento para la Gp-P, que explicarían las diferencias observadas en las diversas publicaciones (Beck et al, 1996). Por estos motivos, hemos seguido las recomendaciones de consenso sugeridas en el trabajo de Beck et al, 1996, para la determinación de la Gp-P por citometría de flujo y del ARNm del gen MDR1 por RT-PCR a fin de unificar los resultados. Para la determinación de la expresión de Gp-P por inmunodetección, la inmunohistoquímica o la citometría de flujo (CF) han sido descritas como técnicas válidas; no así, el Western blotting, por su mayor coste y complejidad, pero sobre todo por presentar tanto casos de falsos negativos, a causa de la activación proteolítica, como falsos positivos, por detectar productos proteicos de otros genes relacionados. En nuestro caso, al trabajar tanto con células de sangre periférica como con cultivos celulares, la técnica de elección recomendada para la valoración de los niveles de expresión de la Gp-P es la citometría de flujo. Hemos empleado en la detección de la Gp-P dos citómetros de flujo, de la misma marca y modelo, ubicados en dos centro diferentes, para analizar la variabilidad que pudiera existir para una misma determinación en laboratorios distintos. Nuestros resultados indican que las determinaciones en diferentes citómetros guardan una alta correlación estadística y que en términos relativos son superponibles las lecturas en ambos aparatos. No obstante, la diferente calibración y energía lumínica del láser de argón así como los diferentes valores de las ganancias en los fotomultiplicadores, determinan que los valores absolutos sean superiores en el CF2 (Centro Regional de Transfusión Sanguínea) que en el nuestro, CF1 (Departamento de Anatomía Patológica). A pesar de que la intensidad de expresión de la Gp-P en las células mononucleadas de sangre periférica es baja, ambos citómetros de flujo detectaron su presencia en las células. Estos resultados apoyan la posibilidad de poder determinar la expresión de la Gp-P de forma reproducible y fiable entre laboratorios si se aplican protocolos de trabajo semejantes. La manipulación de las muestras para la determinación de Gp-P debe ser preferiblemente en fresco o, como máximo, dentro de las 24 horas siguientes a la obtención. En este trabajo, los ensayos se realizaron en el momento de obtener la muestra de sangre periférica por lo que no hubo demora en el procesamiento de la misma. Con la finalidad de calibrar, validar y estandarizar los ensayos de determinación de los niveles de expresión de Gp-P, se analizaron paralelamente dichos niveles en una línea celular con fenotipo MDR que expresaba de forma mantenida y constante Gp-P, como es la línea celular fibroblástica NIH-MDR-G185, y la línea celular parental no amplificada NIH-3T3 (Beck et al, 1996; Beck y Grogan, 1997). Estas líneas celulares se encontraban criopreservadas a -70ºC en medio de cultivo enriquecido con un 5-10% de suero bovino fetal (SBF) y un 10% de DMSO (Lehne et al, 1995). Nuestra experiencia en la determinación de Gp-P, en los ensayos realizados sobre estas líneas ha sido que las modificaciones de los valores obtenidos tras la criopreservación son inferiores al 5% antes y después de la misma y que los resultados son totalmente reproducibles, sin detectar cambio en la antigenicidad dentro de cada lote. La elección del anticuerpo frente a la Gp-P es muy importante desde el punto de vista metodológico y está modulada por diferentes factores. Nuestra experiencia en líneas celulares renales y de otras estirpes es que los mejores resultados se obtienen con el anticuerpo monoclonal JSB-1, seguido por C-494 y MRK-16. La selección del un anticuerpo conjugado con FITC fue debida al intento de conocer la expresión real de la Gp-P sin emplear técnicas de inmunocitoquímica de amplificación. También en la planificación de nuestros ensayos hemos tenido presentes las consideraciones establecidas sobre la elección de los controles para las técnicas de inmunofluorescencia directa. Todas las determinaciones de la Gp-P incluyeron un control isotipo a igual concentración que el anticuerpo frente a Gp-P (Beck et al, 1996; Beck y Grogan, 1997). Para la expresión de resultados han sido propuestas distintas posibilidades:
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NOTAS AL PIE DE PÁGINA: | |
Correspondencia: Morella Guillén. Cátedra de Citología. Facultad de Farmacia. Universidad de los Andes, Venezuela. mailto:morellaguillen@hotmail.com |
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,Olmo A.
