IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA

IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA

CONTENIDO
Abstract	INACTIVACIÓN DE LOS GENES SUPRESORES PTEN, DMBT1 Y P16 EN GLIOBLASTOMA MULTIFORME, ASTROCITOMAS ANAPLÁSICOS Y ASTROCITOMAS DE BAJO GRADO. *Jorge Muñoz, Steve G. Sanko, Xing Fan, Anibal Rincón, Menchu Navarro, Javier Saez Castresana.* Departamento de Genética, Universidad de Navarra. Pamplona, España. IV-CVHAP 2001 PÓSTER-E - 081 Fecha recepción: 14/02/2001 Fecha publicación: 15/02/2001 Evaluación: Ver "Taller de Patología Molecular"
PDF
Comentarios

Título
Resumen
Introducción
Material
Resultados
Conclusiones
Imágenes

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: La pérdida de heterocigosidad (LOH) en el cromosoma 10 es la lesión genética más frecuente en glioblastomas (GBMs), presentándose aproximadamente en un 80% de los casos. La mayor parte de los glioblastomas han perdido una copia entera del cromosoma 10, o bien muestran deleciones a nivel de 10q23-24 en un 80% de los casos, y 10q25-qter, en aproximadamente un 90% de los casos. Dos genes de particular interés de este cromosoma son PTEN en 10q23.3, y DMBT1 en 10q25.3-q26.1. Ambos son genes supresores de tumores recientemente clonados. Se detecta también LOH en astrocitomas en el locus 9p21, en un 30-50% de los astrocitomas primarios. El gen p16/MTS1/CDKN2, localizado en 9p21 es el gen candidato a estudio, y también se comporta como gen supresor de tumores.

MATERIAL Y MÉTODO: Se han estudiado un total de 50 astrocitomas primarios de adultos: 22 glioblastomas (grado IV), 12 astrocitomas anaplásicos (grado III), y 16 astrocitomas de bajo grado (grado II). Los genes supresores analizados fueron p16, PTEN y DMBT1. La extracción de DNA de los tumores se realizó a partir de muestras congeladas del Instituto de Neurología de la Universidad de Tianjin, en China. La tecnología utilizada fue PCR-SSCP y secuenciación para estudio de mutaciones de p16 y PTEN; PCR diferencial para estudio de deleciones homocigóticas de p16, PTEN y DMBT1; y MSP (PCR-metilación específica) para estudio de la metilación en el promotor de p16.

RESULTADOS:

1) GEN p16: El gen p16 se estudió en 21 GBMs, no revelando mutación alguna en sus 3 exones. No se han detectado todavía mutaciones de p16 en ninguno de los 25 astrocitomas de grado II y III analizados, aunque hay PCR-SSCPs positivos en dos casos (un astrocitoma de grado II y otro de grado III) que habrán de caracterizarse mediante secuenciación. Sin embargo, 6 GBMs de 21 (29%), y 2 astrocitomas de grado II (2/12, 17%) presentaron deleciones homocigóticas de p16. También se demostró, mediante MSP que el promotor de p16 sufría hipermetilación en 2 de los 21 GBMs (9%), así como en un astrocitoma de grado II (1/12, 8%).

2) GEN PTEN: Sólo se detectaron alteraciones de PTEN en los GBMs, en concreto: 5 mutaciones en un total de 22 GBMs (23%), así como 3 deleciones homocigóticas entre los 22 GBMs (14%).

3) GEN DMBT1: Se detectaron deleciones homocigóticas de DMBT1 en 1 de 14 GBMs, y 2 de 12 astrocitomas de grado II. El estudio se hizo extensible a 20 líneas celulares de tumores del sistema nervioso (9 astrocitomas, 7 meduloblastomas/PNET, 3 neuroblastomas, y un neuroglioma) de las cuales 3 mostraron deleciones de DMBT1: un astro-oligodendroglioma, un neuroglioma y un neuroblastoma.

CONCLUSIONES:

1) Tras estos estudios concluimos que los genes p16, PTEN y DMBT1 muestran alteraciones (mutaciones, deleciones homocigoticas, e hipermetilación de promotor en el caso de p16) que producen su propia inactivación funcional en astrocitomas de bajo y alto grado. Las frecuencias de tumores alterados corresponden a 13/20 GBMs (65%), y 5/12 astrocitomas de grado II (42%). Entre los astrocitomas anaplásicos (grado III) sólo encontramos una sospecha de mutación de p16.

2) En los GBMs, la proporción de lesión del gen PTEN y del p16 es la misma, mientras que DMBT1 se ve menos dañado (8/20 p16, 7/20 PTEN, 1/14 DMBT1, 3/20 PTEN y p16 en el mismo caso). Entre los astrocitomas de bajo grado, hay 4/12 lesiones de p16, y 2/12 del gen DMBT1 (en 1/12 la lesión es en los dos genes); PTEN no mostró alteraciones en astrocitomas II.

3) Las alteraciones de PTEN sólo se detectan en GBMs. Tal vez una lesión de PTEN detectable en un astrocitoma anaplásico nos haría pensar que ese astrocitoma puede evolucionar a GBM, y, por tanto presentar un peor pronóstico. Pero eso queda por ser demostrado.

4) p16 es el segundo gen más frecuentemente mutado en nuestra serie, y curiosamente no aparece en astrocitomas anaplásicos y sí en astrocitomas de grado II, lo cual hace pensar que los tres tipos de astrocitomas se comportan como entidades nítidamente separadas en su histogénesis, es decir como grupos de tumores primarios, no sujetos a progresión tumoral desde grados II ó III a grado IV.

5) Finalmente, DMBT1 parece tener una participación menor en la génesis de astrocitomas, por lo que, si bien el esfuerzo central de la investigación molecular sobre astrocitomas debe centrarse más en las funciones que ejercen PTEN y p16 como reguladores del ciclo celular, no debemos dejar de lado la posible participación de DMBT1 en un subgrupo de astrocitomas, lo cual podría ser condicionante de su pronóstico o especificidad del tratamiento.

IMÁGENES

Figura 1 : Mutaciones de PTEN detectadas en cuatro glioblastomas mediante PCR-SSCP (arriba) y secuenciación automática (abajo). Las flechas señalan las bandas de SSCP que, por sufrir un patrón de migración electroforética diferente, sugieren la existencia de una mutación puntual (demostrable mediante secuenciación) en el exón concreto en que se han producido.

Figura 2

Figura 3 : Análisis de PCR-SSCP en varios casos de astrocitomas. Se muestran geles de acrilamida al 12% sobre los que se ha realizado una tinción con nitrato de plata. Las flechas indican las posibles mutaciones en los exones 2 (A) y 3 (B). 2B: parte central del exón 2; 2C: extremo terminal (hacia 3’) del exón 2, utilizado en estos experimentos como control positivo de mutación. M, marcador de peso molecular; +, control positivo de mutación; --, control negativo de mutación.

Figura 4 : PCR diferencial para la detección de deleciones homocigóticas de p16. Se utilizó DNA extraído de leucocitos de donantes sanos (B) y de astrocitomas (A) como molde para realizar la PCR. Posteriormente se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2%, y se tiñó el gel con bromuro de etidio. Los fragmentos de DNA son de 230 pb (p16) y 180 pb (STS de control). Las flechas indican posibles deleciones homocigóticas en los tumores A54 y A59. M, marcador de peso molecular; +, control positivo de deleción homocigótica; --, control negativo de PCR.

Figura 5: Análisis de PCR específica para metilación. Gel de agarosa al 2,5 %, teñido con Bromuro de Etidio. Calle primera: marcador de peso molecular. C-: control negativo (PCR realizada sin DNA genómico). LN-405, T24, (líneas celulares, no metilada y metilada, respectivamente), A59, A53 (Muestras de astrocitoma grado II, negativa y positiva de metilación, respectivamente). C-, control de H₂O U: unmethylated (no metidado), M: methylated (metilado).

Figura 7 : Análisis de deleción homocigótica de DMBT1 (en la STS g14, una de las seis zonas de DMBT1 analizadas). Gel de agarosa al 2,5 %, teñido con Bromuro de Etidio. Calle 1: Marcador; B15, B17, B19, B24, DNA extraído de leucocitos de donantes sanos (controles negativos de deleción homocigótica); H4: DNA de una línea de neuroglioma (control positivo de deleción homocigótica de DMBT1); A55: muestra de astrocitoma de bajo grado, positiva; ,A60, A62, A65, A71, muestras de astrocitoma de bajo grado, negativas; G11: muestra de glioblastoma multiforme, positiva; G24, G25, G28: muestras de glioblastoma multiforme, negativas. C-: control negativo (PCR realizada sin DNA genómico).

Figura 8 : Gel de agarosa al 2,5 %, teñido con Bromuro de Etidio. Análisis de deleción homocigótica de DMBT1 en líneas celulares (en la STS g14ext, una de las seis zonas de DMBT1 analizadas). Calle 1: Marcador; B17, B19, B24: DNA extraído de leucocitos de donantes sanos (controles negativos de deleción homocigótica); H4, línea celular de neuroglioma (control positivo de deleción homocigótica de DMBT1); SHY5Y, SKN-FI, MHH-NB11: líneas celulares de neuroblastoma, negativas; MC-IXM, SKN-MC: líneas celulares de neuroblastoma, positivas; SW 1088, MOG-G-CCM: líneas celulares de glioblastoma, negativas. C-: control negativo (PCR realizada sin DNA genómico).

Figura 9 : Gel de agarosa al 2,5 %, teñido con Bromuro de Etidio. Análisis de deleción homocigótica de DMBT1 en líneas celulares (en la STS g14, una de las seis zonas de DMBT1 analizadas). Calle 1: Marcador; B15, B19, B24: DNA extraído de leucocitos de donantes sanos (controles negativos de deleción homocigótica); H4, línea celular de neuroglioma (control positivo de deleción de DMBT1); MC-IXC: línea celular de neuroblastoma, positiva para deleción; MHH-NB11, SKN-MC, IMR32, SHY5Y y SKN-SH: líneas celulares de neuroblastoma, negativas; SW 1088 y MOG-G-CCM; líneas celulares de glioblastoma, negativas.

	INTRODUCCIÓN
	La pérdida de heterocigosidad (LOH) en el cromosoma 10 es la lesión genética más frecuente en glioblastomas (GBMs), presentándose aproximadamente en un 80% de los casos. La mayor parte de los glioblastomas han perdido una copia entera del cromosoma 10, o bien muestran deleciones a nivel de 10q23-24 en un 80% de los casos, y 10q25-qter, en aproximadamente un 90% de los casos. Dos genes de particular interés de este cromosoma son PTEN en 10q23.3, y DMBT1 en 10q25.3-q26.1. Ambos son genes supresores de tumores recientemente clonados. Se detecta también LOH en astrocitomas en el locus 9p21, en un 30-50% de los astrocitomas primarios. El gen p16/MTS1/CDKN2, localizado en 9p21 es el gen candidato a estudio, y también se comporta como gen supresor de tumores.
	MATERIAL Y MÉTODOS
	Se han estudiado un total de 50 astrocitomas primarios de adultos: 22 glioblastomas (grado IV), 12 astrocitomas anaplásicos (grado III), y 16 astrocitomas de bajo grado (grado II). Los genes supresores analizados fueron p16, PTEN y DMBT1. La extracción de DNA de los tumores se realizó a partir de muestras congeladas del Instituto de Neurología de la Universidad de Tianjin, en China. La tecnología utilizada fue PCR-SSCP y secuenciación para estudio de mutaciones de p16 y PTEN; PCR diferencial para estudio de deleciones homocigóticas de p16, PTEN y DMBT1; y MSP (PCR-metilación específica) para estudio de la metilación en el promotor de p16.

RESULTADOS

1) GEN p16: El gen p16 se estudió en 21 GBMs, no revelando mutación alguna en sus 3 exones. No se han detectado todavía mutaciones de p16 en ninguno de los 25 astrocitomas de grado II y III analizados, aunque hay PCR-SSCPs positivos en dos casos (un astrocitoma de grado II y otro de grado III) que habrán de caracterizarse mediante secuenciación. Sin embargo, 6 GBMs de 21 (29%), y 2 astrocitomas de grado II (2/12, 17%) presentaron deleciones homocigóticas de p16. También se demostró, mediante MSP que el promotor de p16 sufría hipermetilación en 2 de los 21 GBMs (9%), así como en un astrocitoma de grado II (1/12, 8%).

2) GEN PTEN: Sólo se detectaron alteraciones de PTEN en los GBMs, en concreto: 5 mutaciones en un total de 22 GBMs (23%), así como 3 deleciones homocigóticas entre los 22 GBMs (14%).

3) GEN DMBT1: Se detectaron deleciones homocigóticas de DMBT1 en 1 de 14 GBMs, y 2 de 12 astrocitomas de grado II. El estudio se hizo extensible a 20 líneas celulares de tumores del sistema nervioso (9 astrocitomas, 7 meduloblastomas/PNET, 3 neuroblastomas, y un neuroglioma) de las cuales 3 mostraron deleciones de DMBT1: un astro-oligodendroglioma, un neuroglioma y un neuroblastoma.

CONCLUSIONES

	NOTAS AL PIE DE PÁGINA:
	Correspondencia: Jorge Muñoz. Departamento de Genética, Universidad de Navarra. Pamplona, España. mailto:jscastresana@unav.es