| IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA | |
|
CONTENIDO |
|
 Abstract |
|
|
PDF |
|
| Comentarios |
|
| Título |
|
| Resumen |
|
| Introducción |
|
| Material |
|
| Resultados |
|
| Discusión |
|
|
Conclusiones |
|
| Referencias |
|
| Imágenes |
|
|
IMÁGENES | ||||||
|
|
|
INTRODUCCIÓN | |
|
El ácido hialurónico (AH) es un glicosaminoglicano de alto peso molecular que forma parte de la matriz extracelular (MEC) del tejido conectivo e interviene en la cohesión tisular. Es el glicosaminoglicano más abundante en la MEC de los tejidos periodontales y tiene como importante propiedad física, su capacidad de embeberse en agua hasta aumentar más de 50 veces su peso seco, lo que da a la matriz un alto grado de elasticidad, favoreciendo el intercambio de gases y moléculas pequeñas, actuando de barrera al paso de macromoléculas y cuerpos extraños (1,2). En los procesos inflamatorios se produce una despolimerización progresiva que altera la arquitectura del tejido y dificulta los intercambios metabólicos. El AH interviene en los procesos de reparación tisular, cicatrización, y por ello se ha postulado su aplicación local como sustancia antiinflamatoria y antiedematosa, sin efectos tóxicos o indeseables (3,4). En este sentido, ha sido usado especialmente para favorecer la cicatrización y prevenir las adherencias en heridas quirúrgicas (5,6) y en procesos artrósicos y artríticos de rodilla (7,8). En Odontología y basado en el mismo principio, también se ha empleado para la cicatrización de intervenciones odontoestomatológicas y maxilofaciales (9) en procesos de reparación dentinaria y regeneración pulpar (10) y en pacientes con diferentes grados de periodontopatías, especialmente gingivitis (11). La formación de la bolsa comienza con un cambio inflamatorio en el tejido conectivo de la pared blanda del surco gingival, originado por la placa bacteriana, el exudado inflamatorio causa la degeneración del tejido conectivo vecino, incluyendo fibras colágenas y gingivales apicales al epitelio de unión (12). Como consecuencia de la pérdida de este soporte fibrilar, la porción apical del epitelio de unión, migra a lo largo de la raíz. La porción coronal del mismo epitelio, se aparta de la raíz a medida que la apical migra, este hecho, la separación de la zona coronal, se debe a un infiltrado creciente de PMN a este nivel, que cuando llega a ser del 60 % o más del volumen del epitelio de unión, el tejido pierde cohesión y se desprende de la superficie dental. En consecuencia, el fondo del surco migra en dirección apical y el epitelio bucal del surco ocupa una porción cada vez mayor del revestimiento del surco (bolsa) (13). El proceso inflamatorio induce a través de heterólisis enzimática, desestructuración del matrisoma del MEC y se producen altos niveles de glicosaminoglicanos en el fluido gingival, principalmente condroitin 4 sulfato, que ha sido utilizado para la confirmación diagnóstica de periodontitis activas, y en menor cuantía AH (14). El efecto reparador de la lesión tisular, basado en la reorganización del tejido conectivo y la actividad fibrogénica, antiinflamatoria y antiexudativa (2, 3, 11) fueron la base para la aplicación del AH en este estudio, cuyo objetivo, fue determinar el efecto de un gel de alto peso molecular del mismo fármaco, sobre diferentes parámetros de la lesión periodontal, la profundidad de bolsa, el infiltrado inflamatorio y el sangrado gingival. |
||
|
|
MATERIAL Y MÉTODOS | |
|
25 pacientes con diferentes grados de periodontitis fueron elegidos al azar de la base de datos de nuestro Centro entre los que en los últimos seis meses no hubieran recibido tratamiento odontológico. A todos los pacientes se les solicitó consentimiento informado para participar en el ensayo clínico, tras recibir la aprobación del Comité Ético de Investigación. Los criterios de inclusión fueron, haber sido atendido previamente en nuestro Servicio, ser adulto mayor de 18 años, tener historia clínica de enfermedad periodontal, no tomar fármacos antiinflamatorios o antibióticos y dar su consentimiento. Los criterios de exclusión fueron no cumplir alguno de los criterios previos o no completar el tratamiento correctamente. Tras la aplicación de los criterios de inclusión e informar a los pacientes, el grupo de estudio quedó reducido a 21 pacientes debido a que dos pacientes recibieron tratamiento con antiinflamatorios durante el tiempo del estudio; dos pacientes no completaron correctamente el tratamiento con el fármaco y el placebo y un paciente no acudió a la segunda exploración realizada al mes. En un maxilar del paciente (el de mayor número de dientes presentes), con la sonda Marquis con códigos de color cada 3 mm, se sondaron por mesial, distal, vestibular y lingual un mínimo de 6 dientes en cada cuadrante. Todos los surcos gingivales con profundidades normales se anotaron con el valor 1,5 mm en la base de datos, (0-3 mm fueron las cifras límites que se consideraron como surco gingival de profundidad normal). Se determinó el sangrado mediante el índice de hemorragia gingival de Dinamo y Bay (15). Para el ensayo clínico a doble ciego, se llevó a cabo un diseño “en boca partida” -split mouth design-, se dividió el maxilar en dos cuadrantes y de manera aleatoria se indicó al paciente en cual debía aplicarse cada gel. En el cuadrante test se aplicó tópicamente el gel de ácido hialurónico de alto peso molecular, (Gengigel; ICN HUBBER, Barcelona, España) cuyo principio activo es hialuronato sódico, y lleva por excipientes: celulosa, agua, xilitol, aceite hidrogenado de castor, alcohol de polivinilo, policarbofil, aroma, hidróxido sódico, CI 42090) y en el cuadrante contralateral o control un placebo (orabase). La forma de aplicar ambos geles fue con el dedo, después del cepillado, en todo el cuadrante por vestibular y lingual, dos veces al día. Al inicio del estudio a todos los pacientes se les instruyó para mantener una correcta higiene oral. Tras un mes de tratamiento con el gel, los pacientes volvieron de nuevo a ser examinados. Se practicó una biopsia de papila gingival, por vestibular entre el segundo premolar y el primer molar en ambos cuadrantes, para estudio histopatológico en cada paciente. Las muestras inmediatamente después de su extracción fueron fijadas en formol tamponado al 4%, incluidas en parafina y cortadas a 4 mm de espesor para ser teñidas con hematoxilina–eosina. La gradación del infiltrado inflamatorio se estableció contabilizando al azar 10 campos de lámina propia a gran aumento (400x), considerando como “Ausencia”: Cuando no se evidenciaron células inflamatorias en ninguno de los 10 campos. “Leve”: Presencia de células inflamatorias en menos de 5 campos ocupando <50% de la extensión del mismo. “Moderado”: Presencia de infiltrado inflamatorio en más de 5 campos ocupando >50% de la extensión del mismo. “Intenso”: Infiltrado inflamatorio en los 10 campos evaluados ocupando >90 % de su extensión. La variable morfológica se categorizó como ordinal con cuatro valores “ausencia, leve, moderada e intensa”. Con técnicas inmunohistoquímicas se estudiaron la expresión del antígeno de proliferación Ki-67 y de la ciclina dependiente de cinasa P27 kip1. Brevemente, las secciones histológicas tras ser desparafinadas e hidratadas fueron tratadas con calor en olla presurizada para conseguir el desenmascaramiento antigénico. La incubación se mantuvo con los anticuerpos anti-Ki-67 (clon MIB1) y P27 kip1 (clon ) a dilución 1:40 y 1:100 respectivamente, durante 60 minutos (Master Diagnóstica, España) empleando el método de estreptavidina-biotina fosfatasa alcalina en un inmunoteñidor automático (Labvision, Fremont CA, USA). Se contabilizó el número de núcleos positivos para el anticuerpo en el epitelio gingival por campo de gran aumento expresando los resultados en número de células positivas por mm². El estudio in vitro se realizó con la línea fibroblástica de ratón 3T3 (cedida por la Dra. Carol Cardarelli del NIH de Bethesda, USA) cultivada en condiciones estándar con DMEM (4.5 g/L de glucosa) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor como control e incubando con 0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2 mg/mL de Ácido hialurónico (Sigma) durante 7 días en los grupos problemas. El efecto sobre la proliferación celular se estableció mediante estudio del ciclo celular por citometría de flujo con la solución de Vindelov que contienen yoduro de propidio (IP) y RNAsa (Sigma). Previamente a dicha determinación se comprobó la viabilidad celular con los colorantes IP+FDA (diacetato de fluoresceína) (Sigma) en un mínimo de 1x106 células/determinación. Las determinaciones fueron realizadas por triplicado en experiencias independientes. ANÁLISIS DE LOS DATOS: Tras realizar un análisis descriptivo se procedió a realizar un análisis bivariante estratificado para determinar asociaciones entre las variables analizadas. Para ello se utilizó la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon y la prueba de McNemar. Se estratificó la muestra en controles y test. El nivel de confianza escogido en todo el análisis fue del 95%. El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa SPSS-Windows 9.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). |
||
|
|
RESULTADOS | |
|
En la muestra, 8 pacientes fueron mujeres (72,7%) y 3 hombres (27,3%) con una edad media de 45,45 años (IC 95% 38,22-52,69, s = 10,77) El resultado de la profundidad de bolsas iniciales en los cuadrantes control y test fueron muy parecidos, mientras que los obtenidos al final del estudio sólo presentaron resultados similares las profundidades de bolsas mesiales y vestibulares. La media de las profundidades del surco en las superficies distales fueron de 3,34 mm en el cuadrante control (IC95% 2,97-3,71) y 2,98 (IC95% 2,61-3,35) en el test. Cuando se compararon con las cifras de profundidad de bolsa inicial, encontramos una diferencia estadísticamente significativa en distal de los controles (test de Wicoxon: Z= -2,786, p=0,005) con un claro aumento de la profundidad de bolsa al final del estudio. No hubo diferencias en la profundidad de bolsa de las superficies distales en los cuadrantes test (2,86 mm inicial frente a 2,98 mm final). La media de profundidad de bolsa en las superficies linguales medidas al final del estudio volvió a mostrar diferencias entre los cuadrantes control (2,86- IC95% 2,47-3,25) y test (2,30- IC95% 1,97-2,63). Cuando se comparó con las cifras iniciales, encontramos una diferencia significativa sólo en los cuadrantes test (test de Wilcoxon:Z=-2,625, p= 0,009). Con ambos tipos de tratamiento, orabase y AH (Gengigel), hubo una reducción significativa del sangrado al final del estudio. Así, en los cuadrantes control, si bién 4 de los 11 pacientes empeoraron, se pasó del sangrado gingival inicial de 46 dientes (75,40%) a 32 (52,5%) con una significación exacta según la prueba de McNemar de p= 0,004, y en los cuadrantes test, con un sangrado inicial en 42 dientes (68,85%) se redujo al final, también de manera significativa, a 31 unidades sangrantes (50,8%). (p= 0,019). El número total de dientes explorados para el sangrado, al principio y al final del estudio fueron 61. Las secciones gingivales presentaron un infiltrado inflamatorio crónico con diferente grado de intensidad, principalmente compuesto por linfocitos, células plasmáticas maduras y macrófagos dispuestos en parches en la lámina propia, frecuentemente rodeando estructuras vasculares (Figura 1). En los pacientes con infiltrados inflamatorios más intensos se observaba exocitosis hacia el epitelio mucoso con ligeros fenómenos de espongiosis. Se demostró una asociación significativa entre los cuadrantes que habían recibido tratamiento con AH y la ausencia de infiltrado inflamatorio (residuo tipificado corregido= 2,9). Aunque con los demás grados no hubo asociación, se pudo observar como en los controles, el 63,7% de las biopsias presentaron un infiltrado inflamatorio moderado-severo, mientras que este mismo tipo de infiltrado, sólo lo presentaron el 18,2% de las biopsias obtenidas en los cuadrantes test al final del estudio (Tabla I). Tras el tratamiento con AH se obtuvo la reducción del infiltrado inflamatorio en 7 pacientes (63,6% ) (Figura 2). Sobre el epitelio gingival el HA induce disminución significativa del índice de proliferación 772±141 células positivas para Ki-67 por mm² frente a 917±74 por mm² (t de Student p<0.0001, intervalo de confianza 754.2-1080.6) (Figura 3, Figura 4). No se observó inmunotinción en células fibroblásticas en lámina propia. En un número significativo de pacientes disminuyeron las células inflamatorias Ki-67 positivas en el infiltrado inflamatorio crónico presente en la lámina propia. Sin embargo no se apreció reducción del número de células positivas para P27 (2872±332 células positivas por mm² en área control frente a 2795±481 por mm² en el área gingival tratada). In vitro el AH a dosis de 1.5 y 2 mg/mL incrementó el porcentaje de células 3T3 en fase G0-G1 y redujo de forma significativa el porcentaje de células en S y G2-Mitosis (Figura 5, Figura 6). |
||
|
|
DISCUSIÓN | |
|
El AH es un glicosaminoglicano de alto peso molecular de la MEC involucrado en procesos de crecimiento e inflamación/reparación, que proporciona hidratación y propiedades plásticas a la piel y las mucosas como la gingival. Se discute sobre la capacidad de penetración del AH en aplicación tópica. Laugier et al. han demostrado que el AH no penetra a través del estrato córneo de la piel y por ello tiene escaso efecto sobre la expresión del receptor CD44 (16); pero no existen estudios sobre la penetrabilidad por la mucosa de la encía y surco gingival que carecen de este estrato. Nosotros hemos valorado el efecto del AH sobre la profundidad de las bolsas periodontales y el sangrado gingival, dos signos clínicos de inflamación periodontal. Hemos podido demostrar como al cabo de un mes de tratamiento con AH, mantenían unas profundidades de bolsas parecidas a la iniciales, excepto las superficies linguales, que mostraron una reducción significativa de 0,32 mm de profundidad media. Las lesiones periodontales en los cuadrantes controles, aumentaron en todas las superficies exploradas, con un aumento significativo de 0,40 mm en las superficies dístales. Aunque no hemos encontrado en la literatura ningún trabajo que haya estudiado el efecto del AH en la bolsa periodontal, pensamos que estos resultados se deben a un efecto del fármaco sobre el proceso inflamatorio. En los cuadrantes control, la gingivitis progresiva sería la responsable del aumento del sondaje. Es conocido como en la inflamación crónica, la encía aumenta de volumen y el margen gingival se extiende hacia la corona (17). Los resultados extraídos de las biopsias confirman este hecho, ya que en los cuadrantes control se mantiene e incluso aumenta el infiltrado inflamatorio, mientras que se observa una clara disminución del infiltrado inflamatorio en los cuadrantes test, donde la profundidad del sondaje se mantien o disminuye. La inflamación periodontal está caracterizada por la acumulación de células inflamatorias en el tejido conectivo-vascular. El efecto del AH sobre el proceso inflamatorio, ha sido recientemente explicado desde aspectos diferentes, así, Cortivo et al. (1) y Weigel et al.(2) describen un efecto físico, de barrera, para los gérmenes y sus productos en la MEC. Haapasalo et al. han demostrado la unión de este proteoglicano mediante una proteína superficial, la quimotripsina, al Treponema Dentícola, germen aislado en las lesiones periodontales, impidiendo la acción destructiva del mismo sobre los tejidos gingivales (18). Más recientemente ha sido demostrado, que el AH es el principal ligando del receptor CD44 (19). El papel fisiológico de este receptor es mantener la estructura orgánica y tisular a través de la adhesión célula-célula y célula-matriz (19). Isoformas del receptor CD44 están implicadas en la unión inicial de los leucocitos a las células endoteliales activadas por procesos inflamatorios (20). La extravasación de leucocitos de los vasos sanguíneos en respuesta a estímulos fisiológicos o patológicos se establece por medio de interacciones receptor-ligando entre leucocitos y células endoteliales. Está demostrado que se corresponde con un modelo en múltiples pasos y la unión CD44, presente en los linfocitos T activados al AH endotelial, media la adhesión inicial de las células inflamatorias al vaso que permite la extravasación en el lugar de la inflamación y su posterior acumulación en el foco flogógeno (21). También Murakami et al. consideran que la persistencia del infiltrado inflamatorio linfocitario en la lámina propia se debe a la intensa unión de éste con los fibroblastos gingivales mediado al menos por las moleculas de adhesión VLA de la familia de las integrinas, LFA1/ICAM-1 y CD44/AH (22, 23). En nuestro caso hemos demostrado una reducción en la capacidad proliferativa local de células epiteliales e inflamatorias por reducción de la expresión de Ki-67. La acción del AH en estos procesos, a través de un mecanismo aún desconocido, podría ser la explicación de la reducción del infiltrado inflamatorio en la lámina propia gingival. Pagnacco et al. en un estudio de gingivitis marginal, de diseño parecido al nuestro, demuestran un efecto profiláctico y terapéutico significativo del AH, mejorando el enrojecimiento, sangrado e inflamación de la mucosa gingival (24). Nosotros, también hemos encontrado mejoría significativa en el sangrado gingival en ambos grupos. La mejoría del sangrado en los sectores gingivales controles posiblemente es debido en parte a la mejor higiene oral propiciada por el correcto cepillado, ya que no se realizó otro tipo de tratamiento odontológico y en las biopsias de papila no se observó disminución significativa de la inflamación. También los resultados quizás sean debidos al índice de sangrado empleado, el de Ainamo y Bay (15), que sólo anota de cada diente si sangra o no. Reconocemos que habría sido más completo, explorar el sangrado gingival en el surco de las cuatro superficies dentarias. De esta manera se habría obtenido más información de este signo y seguramente las diferencias habrían sido más favorables para los cuadrantes tratados con AH. Nuevos estudios a largo plazo que incluyan determinación de inserción clínica, podrán poner de manifiesto la acción del fármaco sobre el periodonto de inserción, especialmente a través de su efecto fibrogénico, determinado su utilidad reparadora del ligamento periodontal y de la arquitectura fibrilar subgingival, tan lesionadas en las periodontitis. |
||
|
|
NOTAS AL PIE DE PÁGINA: | |
Correspondencia: F. L. Mesa Aguado. Dpto. Anatomía Patológica, Facultad de Medicina. Universidad de Granada, España. mailto:fovalle@ugr.es |
||
