IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA IV-CVHAP

CONTENIDO

 

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EFECTIVIDAD DE ANTICUERPOS CADUCADOS EN TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA.

Fátima Yebra, Alfonso Fernández, José Antonio Ortiz-Rey, Carolina Gómez de María, Ana De la Fuente.

Servicio de Anatomía Patológica. Policlínico Vigo, S.A. (POVISA). Vigo, Pontevedra, España.

IV-CVHAP 2001 COMUNICACIÓN-E - 039

Fecha recepción: 14/02/2001
Fecha publicación: 10/02/2002
 Evaluación: Ver "Taller de Inmunohistoquímica"

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width=5 Comentarios
 
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width=5 Resumen
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RESUMEN
 
   Objetivos: Con el fin de agotar aquellos anticuerpos primarios ya caducados y por consiguiente, reducir costes en las técnicas de inmunohistoquímica, hemos investigado si con dichos viales, la calidad de la inmunotinción era satisfactoria. 

   Material y métodos: Se realizaron técnicas de inmunoperoxidasa a 228 casos con anticuerpos primarios EPOS ( CK-10, FVIII, LCA, PSA, CD-20) y prediluídos (bcl-2, colágeno IV, 34bE-12, CD-31, CD-68) (Dako), que superaban la fecha de caducidad en 1-19 meses. 

   Resultados: La técnica se valoró microscópicamente, y se encontró que la calidad de la tinción no disminuía en ninguno de los casos estudiados. 

   Conclusión: En algunos países actualmente existen leyes que prohíben la utilización de anticuerpos caducados en inmunohistoquímica; no obstante existen estudios que, como el nuestro, demuestran que los resultados pueden ser satisfactorios aun usando dichos reactivos. De todas formas recomendamos métodos alternativos como la congelación de dichos viales o su conservación en congelador una vez mezclados con glicerol.


   Palabras clave:  inmunohistoquímica | anticuerpo | técnica histológica | artefacto | caducidad

INTRODUCCIÓN
   
   Todos los anticuerpos que se utilizan en inmunohistoquímica tienen una serie de normas de uso marcadas por el fabricante, como son: la temperatura a la que deben ser almacenados ( 2-8º C ó –20º C), o la fecha límite de utilización. Por lo general, esta fecha suele tener un margen de utilización de varios meses después de su fabricación.

   Dichas normas han de cumplirse para el correcto funcionamiento de los anticuerpos, lo que supone un mayor coste en caso de que los viales hayan caducado sin haber sido agotados en su totalidad. Por esa razón, en este trabajo se investiga si los resultados finales de dicha técnica, se ven afectados por la utilización de anticuerpos primarios caducados(1,2,3,4); ya que en ocasiones los viales podrían llegar a su fecha de caducidad sin haberse agotado.
   

MATERIAL Y MÉTODOS
 
   Para la realización de este trabajo, desempeñado en el servicio de Anatomía Patológica de POVISA (Vigo), se utilizaron 11 anticuerpos primarios caducados:

   5 de ellos eran anticuerpos conjugados con polímero y peroxidasa: CK-10, FVIII, LCA, PSA, CD-20, utilizando la técnica EPOSÒ (DAKO)(5) (Tabla 1).

pasos

tiempo

1

Hidratar con alcoholes decrecientes.

 

2

Lavar en agua destilada.

 

3

Lavar en TBS.

5-10 min.

4

Recuperación antigenica en olla a presión con buffer citrato.

5 min.

5

Temperar.

20 min.

6

Lavar en agua destilada.

 

7

Lavar en TBS.

5-10 min.

8

Incubar en agua oxigenada 3%.

10 min.

9

Lavar en agua destilada.

 

10

Lavar en TBS.

5-10 min.

11

Incub. con anticuerpo conjugado con polímero y peroxidasa

60 min.

12

Lavar en TBS.

 

13

Revelado con DAB + sustrato(H2O2)

Hasta un máximo de 5 min.

14

Lavar en agua destilada.

 

15

Contraste con Hematoxilina de Mayer.

Aprox. 30-60 seg.

16

Deshidratar –Xilol-Montar.

 

Tabla 1: Técnica de Polímero conjugado con peroxidasa y anticuerpo(EPOS®).

    Los restantes eran monoclonales prediluídos(DAKO): bcl-2, colágeno IV, 34b E-12, CD-31, CD-68, utilizando la técnica de biotina-estreptavidina marcada (LSAB® DAKO) (5) (Tabla 2).

 

PASOS

TIEMPO

1

Hidratar con alcoholes decrecientes

 

2

Lavar en agua destilada

 

3

Lavar en TBS

5-10 min.

4

Recuperación antigénica en olla a presión con buffer citrato

5 min.

5

Temperar

20 min.

6

Lavar en agua destilada

 

7

Lavar en TBS

5-10 min.

8

Incubar en agua oxigenada 3%

10 min.

9

Lavar en agua destilada

 

10

Lavar en TBS

5-10 min.

11

Incubación con anticuerpo primario

30 min.

12

Lavar en TBS

5-10 min.

13

Incubación con Anticuerpo biotinilado

10 min.

14

Lavar en TBS

5-10 min.

15

Incub. con estreptavidina conjugada con peroxidasa.

10 min.

16

Lavar en TBS

5-10 min.

17

Revelado con DAB+sustrato(H2O2)

Hasta un máximo de 5 min.

18

Lavar en agua destilada

19

Contraste con Hematoxilina de Mayer

Aprox. 30-60 seg.

20

Deshidratar-Xilol-Montar

Tabla 2: Técnica de Biotina-Estreptavidina marcada (LSAB®).

   Con dichos anticuerpos se realizó la técnica de Inmunohistoquímica a 228 casos comprendidos entre Febrero de 1999 y Agosto de 2000, correspondientes a secciones de piezas enviadas al laboratorio en formol tamponado al 10%, procesadas e incluidas en parafina (5-7), aplicando los métodos de inmunotinción señalados (Tablas 1 y 2). La recuperación antigénica se realizó con buffer citrato, pH 6.0,en olla a presión, durante 5 minutos.

   Una vez finalizada la técnica se valoraron los resultados de ésta al microscopio, sobre controles positivos, calificándolos como:

Negativo (-), cuando no había tinción en los controles positivos.

Positivo (++), cuando esta era adecuada.

Muy positivo (+++), cuando la calidad era excelente.

RESULTADOS


  La calidad de la inmunotinción fue excelente en todos los casos, no viéndose afectada por la caducidad de los anticuerpos primarios empleados (Tabla 3) .

AC

CLON

MARCA

REF.

LOTE

CADUCID. MESES

DILUCIÓN

Nº de casos

INMUNO REACTIVIDAD

Bcl-2

124

DAKOÒ

N1587

037-4

19

Prediluído

40

+++

Colágeno IV

CIV-22

DAKOÒ

N1536

00126

11

Prediluído

40

+++

34b E-12

34b E-12

DAKOÒ

N1553

0057

5

Prediluído

20

+++

CD-31

IC/70A1

DAKOÒ

N1596

048-4

11

Prediluído

3

+++

Colágeno IV

CIV-22

DAKOÒ

N1536

0028-1

13

Prediluído

20

+++

CD-68

KP-1

DAKOÒ

N1577

038-4

1

Prediluído

5

+++

CK-10

DE-K10

DAKOÒ

U7048

027

19

EPOSÒ

2

+++

FVIII

Policlonal

DAKOÒ

U0034

116(101)

13

EPOSÒ

7

+++

LCA

2B11PD7/26

DAKOÒ

U7024

105

7

EPOSÒ

19

+++

PSA

Policlonal

DAKOÒ

086(101)

U0035

5

EPOSÒ

30

+++

CD-20

L26

DAKOÒ

064(501)

U70210406450

16

EPOSÒ

42

+++

Tabla 3: Características e inmunorreactividad de los anticuerpos primarios utilizados después de su fecha de caducidad.

§ AC: Anticuerpos

REF.:Referencia

CADUCID. MESES : Caducidad meses

   

DISCUSIÓN
 


   Los anticuerpos primarios caducados podrían ser utilizados, realizando al mismo tiempo controles positivos y negativos (1,6). Éstos deberían ser valorados por los técnicos de anatomía patológica y patólogos, para asegurar su correcto estado pudiendo establecer así un diagnóstico fiable y seguro.

   A pesar de que la inmunotinción no se ve afectada por la utilización de dichos anticuerpos en nuestro caso, es recomendable que los sueros se consuman en su totalidad antes de su fecha de caducidad. Para evitar llegar a esta fecha sin que se hayan agotado los viales, se puede recurrir al método de "congelación" o al de mezcla de éstos anticuerpos concentrados con glicerol (4) . Dicha mezcla se hace en alícuotas, que se guardarán en un congelador a -20ºC, posteriormente se prepara la solución de trabajo en el mismo día de su utilización. No se recomienda realizar congelaciones y descongelaciones repetidas de una determinada alicuota.

   Ya que los resultados de la inmunohistoquímica realizada, fueron satisfactorios (Tabla 3), creemos que los fabricantes deberían revisar los períodos de utilización recomendados, debido a que en algunos países, como Francia y Estados Unidos, existen leyes que prohiben la utilización de anticuerpos caducados.  
   

CONCLUSIONES
 
   La utilización de anticuerpos primarios prescritos puede ser necesaria en inmunohistoquímica en algunos casos. Para ello, deberían realizarse al mismo tiempo controles internos que asegurasen la calidad de la inmunotinción. Todo esto supone un ahorro importante para el servicio de Anatomía Patológica, ya que los viales pueden ser agotados en su totalidad.

   A pesar de que los resultados de la técnica de inmunohistoquímica, en nuestro caso, no se ven afectados por la utilización de estos anticuerpos, recomendamos métodos alternativos como la congelación del anticuerpo concentrado o la mezcla del mismo con glicerol y conservación en congelador, asegurando así que las características de los viales permanecen intactas.
   

REFERENCIAS
 
1. Balaton A.J. , Drachemberg C.B., Rucker C., Vaury P., and Papadimitriou J.C. Satisfactory Performance of Primary Antibodies Beyond Manufactures Recomended Expiration Dates.App Inmunohistochem 7(3):221-225,1999.

2. Tubbs R.R., Nagle R., Leslie K., Pettigrew N.M., Said J.W., CorwinD.J., Rickert R.R., Roche P.C., for the Cell Markers Commitee of the College of American Pathologists.Extension Of Useful Reagent Shelf Life Beyond Manufacturers´ Recomendations.Arch Pathol Lab Med 1998: 122:105100-2.

3. Rucker C, Newkirk C, Raymond J. Papadimitriou JC. Drachenberg, C Stability of Antibodies for inmunohistochemical staining after 6-42 months of standard storage. Arch Anat Cytol Path Clin Exp Pathol 1998; 46:602.

4. Montoya A, Castell JV.Long-term storage of peroxidase-labellled inmunoglobulines for use in enzyme inmuassay. J Inmunol Methods 1987 May 4; 99(1): 13-20.

5. A Guide To Desmasking Of Antigen On Formalin-Fixed, Parafin-Embedded Tissue.DAKO, Denmark. April 1997.

6. Laboratory Histopathology: A Complete Reference.Edited By Anthony E Woods, Roy Ellis. Churchill Livingstone E, 1994.

7. Fernández A., Yebra F., Ortiz-Rey J.A., Bangueses S., Rey M.L., Gómez De María C., De La Fuente A. Unidades De Diagnostico Rápido: Influencia Del Procesado En Microondas En La Inmunorreactividad Del Tejido. XII Congreso Nacional de Técnicos de Laboratorio.Mayo, 1999.Canarias.