IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA |
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Abstract |
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INTRODUCCIÓN | ||
Moritz Kaposi describió en 1872 un raro tumor cutáneo en varones ancianos de origen mediterráneo que ahora lleva su nombre, el sarcoma de Kaposi (SK). Este tipo de neoplasia fue considerada como una rareza hasta la irrupción del SIDA, pero en estos momentos se conocen claramente sus cuatro formas epidemiológicas: la clásica, la endémica africana, la relacionada con iatrogénica y la relacionada con el SIDA. Hace más de seis años que se identificó la presencia de un nuevo virus de la familia del virus herpes humano en el SK (Chang 94). Este virus se conoce con el nombre de herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV) o Virus del herpes humano tipo 8 (VHH8). Este virus se ha detectado en el 95% de los casos de SK asociados o no al SIDA (Marchioli 96, Gómez-Román 99), y parece que se puede definir una relación constante y consistente entre la infección por VHH8 y el desarrollo de todas las formas de SK (Lin 96). Sin embargo, todavía no se conoce exactamente si VHH8 transforma directamente a las células fusiformes precursoras del SK o si el papel es indirecto a través de citoquinas necesarias para un proceso angiogénico y la agregación de células inflamatorias (Whitby 98, Gallo 98). El análisis del patrón de transcripción viral en estas lesiones podría ser de interés y de hecho, se han demostrado claras diferencias entre la expresión viral en SK, linfomas de cavidades (Parravicini 2000) y otras lesiones asociadas con el VHH8 como el pseudotumor inflamatorio pulmonar (Gómez-Román 2000), aunque es preciso señalar que la mayoría de los estudios se han realizado en líneas celulares y no in vivo (Sarid 98). Por otro lado, el SK se limita usualmente a la piel, pero en los casos más agresivos puede diseminarse a membranas mucosas y órganos internos. La afectación extracutánea podría representar diseminación metastásica o bien sólo multifocalidad en la aparición de lesiones. Con respecto a este tema, algunos autores han demostrado un origen policlonal en algunas lesiones de SK (Gill 98), pero otros autores describen un patrón oligo o monoclonal en las estructuras virales en la mayoría de las lesiones de SK examinadas (Russo 96). Nuestra intención es estudiar la expresión viral in vivo y sus posibles variaciones en la evolución de las lesiones de un SK clásico con afectación multifocal en los tres estadios histopatológicos clásicos de la enfermedad.
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MATERIAL Y MÉTODOS | ||
CASO CLÍNICO: Paciente varón de 77 años de edad sin antecedentes clínicos de interés en cuanto a posible inmunosupresión, HIV negativo, y sin toma de fármacos habitual, acudió a consulta de dermatología por presentar una lesión plana, maculosa de bordes bien definidos y color rojizo en el antebrazo derecho de meses de evolución. Dicha lesión fue extirpada con el diagnóstico de Sarcoma de Kaposi en estadio maculoso. Tres meses después el paciente acudió de nuevo a la consulta por presentar otra lesión en el hombro izquierdo, de aspecto nodular y color rojizo de 0,5 cm de diámetro de aparición súbita. La lesión fue asimismo extirpada con el diagnóstico de SK en estadio tumoral. Ocho meses después, el paciente acudió en esta ocasión por la presencia de una lesión nodular de 0,8 cm localizada en el pabellón auditivo externo de las mismas características a la extirpada previamente. El paciente fue intervenido con el mismo diagnóstico. Cinco meses después, el paciente notó una tumoración de crecimiento rápido, ulcerada de 2 cm de diámetro en superficie mucosa del labio inferior. La lesión fue extirpada y el diagnóstico fue de SK extracutáneo con alto índice mitótico y características intensas de atipia celular. INMUNOHISTOQUÍMICA: En todos los casos se practicaron técnicas inmunohistoquímicas frente a marcadores endoteliales (CD-31) que resultó positivo. Se realizó asimismo, marcador de proliferación celular (Ki67) que resultó escasamente positivo en los primeros estadios y que aumentó en porcentaje de núcleos celulares teñidos en la biopsia de lesión extracutánea. EXTRACCIÓN DE ADN: En todos los casos, procedimos a la extracción de ADN a partir de material fijado en formol e incluido en parafina. Usamos el kit NucleoSpin C+T (Macherey; Nagel Gmbh, Düren, Alemania). Todas las muestras fueron sometidas a una amplificación del exón 8 del gen inhibidor de C1 como control interno de calidad del ADN extraído. Para la detección de ADN de VHH8 usamos un procedimiento de PCR-nested como ha sido descrito previamente (Moore 96), frente a una región de 571 bp en la reacción externa y de 233 bp en la región KS330233. La confirmación de los resultados se llevó a cabo amplificando regiones no sobrelapadas de genes mayores de cápside como ha sido sugerido por otros autores (Moore 96). RT-PCR Y EXTRACCIÓN DE RNA:
La extracción de RNA total se realizó usando una técnica basada en fenol/isotiocianato de guanidina y cloroformo con TRIzol (Life Technologies, Barcelona. España), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eliminar cualquier resto de DNA contaminante genómico, las muestras se trataron con DNAsa RQ1 (Promega, Madison, WI, USA). Sintetizamos 5 μg de cDNA por medio de una transcripción reversa usando hexanucleótidos random primers y Superscript II RNAsa H minus (Life Technologies, Barcelona, España). Los primers usados para detectar los tránscritos examinados se documentan en la
tabla I. La información de las secuencias se obtuvo del Genbank database a partir del Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI)
Tras inactivación por calor de la transcriptasa reversa, de cada cDNA se utilizó para amplificación en un termociclador Perkin-Elmer 9600. Las condiciones fueron desnaturalización inicial 2 min a 941C. 40 ciclos de desnaturalización (941C 30 seg), annealing (641C 45 seg) y extensión (721C 45 seg). En todos los casos se amplificó la secuencia del RNA ribosomal 18S para asegurar la presencia de RNA en buenas condiciones. Las mismas reacciones de PCR se realizaron con RNA total sin el paso de transcriptasa reversa como un control negativo para eliminar la posibilidad de la presencia de DNA genómico como fuente de contaminación. El análisis de los productos de PCR se realizó en todos los casos mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio.
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RESULTADOS | ||
Las biopsias fueron revisadas sin conocer el diagnóstico por dos patólogos de nuestra institución para confirmar el diagnóstico de SK. La primera biopsia mostró una proliferación poco agresiva de canales endoteliales en la dermis superficial sin cambios epidérmicos consistente con estadio macular de SK. La segunda y tercera biopsia mostraron unas lesiones polipoides con una proliferación de células fusiformes con luces y globos intracitoplasmáticos Pas positivos inmersas en un estroma inflamatorio. La última biopsia mostró una lesión de bordes mal definidos, ulcerada formada por células fusiformes con gran atipia nuclear y elevado índice mitótico. Los marcadores inmunohistoquímicos frente a antígenos endoteliales (CD31) resultaron positivos en todos los casos. Se detectaron secuencias de ADN de VHH8 en todos los casos y en las tres diferentes PCRs que practicamos. Los resultados del análisis de RNA se muestran en la tabla II. Existieron diferencias entre los tres estadios. En la lesión maculosa se demostró expresión de Bcl-2, Timidina kinasa, vFLIP, Ciclina D, vCGR, FGARAT, vIL6 y Proteínas mayor y menor de la cápside (Figuras 1, Figura 2 y Figura 3). En las lesiones tumorales se expresaron la mayor parte de genes excepto vIL6 y la proteina menor de cápside. La principal diferencia entre el estadio tumoral y el extracutáneo fue la expresión masiva de genes de clase I y II (constitutivos) en la lesión extracutánea y la pérdida de expresión de proteínas de cápside en ésta última lesión. |
DISCUSIÓN | ||
El KSHV o VHH8 es un Rhadinovirus (de la palabra griega =frágil), relacionado muy estrechamente con el herpesvirus saimiri y el citomegalovirus. Hoy en día todavía se desconoce si el papel que juega en el SK es directo, transformando células precursoras para la formación de las lesiones o si el papel es indirecto vía citoquinas inflamatorias (Whitby 98). En cualquier tipo de infección viral existen dos estadios con características claramente definidas, latente y lítica, cada una de las cuales está asociada con fenómenos biológicos y patogenéticos diferentes. El VHH8 puede encontrarse en forma de DNA extracromosómico episomal en estadios latentes o como forma lineal incorporada en el genoma del huésped en las fases líticas de la infección (Gilison 97). Se han demostrado tránscritos de VHH8 en la gran mayoría de las células fusiformes en las lesiones de SK con un patrón de expresión sugestivo de fase latente en la mayoría de las células (Ganem 97), aunque hay que destacar que estos estudios fueron practicados en líneas celulares. Sin embargo, parece cada vez más cierto que la expresión de genes virales en líneas celulares infectadas por VHH8 no refleja de forma segura lo que ocurre en los tejidos infectados (Parravicini 2000). Existen escasas publicaciones que utilicen métodos de hibridación en biopsias, y éstas muestran que un 3% de las células fusiformes en el SK expresan homólogos de citoquinas proinflamatorias y factores antiapoptóticos compatibles con un ciclo viral lítico (Sun 99). Por otro lado, en el SK asociado al SIDA, entre un 1 a un 5% de las células fusiformes se encuentran en una fase lítica (O'Leary 97), y de hecho inhibidores de la DNA polimerasa como el foscarnet se han asociado a regresiones clínicas de las lesiones en el SK (Brooks 97). Este hecho es sorprendente porque los dogmas establecidos nos señalan que la replicación lítica es fatal para las células y que por tanto dicha fase lítica no puede contribuir a la tumorigénesis (Chang 2000). Sin embargo, es posible que una población minoritaria de células infectadas en una fase lítica viral sea importante en el sostenimiento de las lesiones de SK reclutando constantemente nuevas células tumorales infectadas directamente o a través de mecanismos paracrinos (Ganem 97). Nosotros hemos demostrado que en el SK clásico, en el mismo paciente y en diferentes estadios clínico-patológicos se expresan diferentes genes tanto de fase lítica como latente (clases I, II y III). Nuestra hipótesis favorecería que el SK podría aparecer en pacientes infectados con el VHH8 en una fase latente del ciclo viral, en los que un proceso de inmunosupresión o cualquier hecho que afecte al equilibrio intrínseco del ciclo celular provocaría una nueva fase de ciclo lítico. Hay que destacar que se ha descrito recientemente cómo la disminución en la inmunoreactividad para p27kip1 está relacionada con la afectación extracutánea y un elevado índice de agresividad biológica en SK (Fernández-Figueras 2000). El posible reclutamiento de nuevos clones celulares infectados haría que las lesiones de SK aparecieran en cualquier tejido y en cualquier momento. Se ha demostrado que varias citoquinas (como el interferón alfa) pueden inhibir el estadio replicativo viral y provocar una reentrada en el ciclo latente de nuevo (Chang 2000), con lo que el equilibrio entre factores pro-replicativos y factores inhibidores de la replicación viral provocaría el aclaramiento o la progresión de las lesiones. En cuanto al patrón de expresión viral que hemos hallado, el homólogo del receptor emparejado con la proteína G (GCR) es una molécula muy potente que provoca una proliferación celular y angiogénesis vía factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Esta molécula aparece en todas las lesiones estudiadas salvo en una de las dos biopsias correspondientes al estadio tumoral. Por otro lado, la Interleukina 6 viral puede estimular todas las vías de señalización intracelulares y contribuir a la progresión de la enfermedad por estímulo de factores de proliferación e inhibición de apoptosis. En nuestro caso, aparece en los estadios iniciales de la enfermedad, pero de forma más intensa en el estadio extracutáneo, siendo este hecho similar a lo que ocurre con T1.1/nut1 que también se expresa predominantemente en lesiones avanzadas. La ciclina D y el Bcl-2 se expresan de forma constante en todos los estadios, con lo que parece fundamental su aportación al desarrollo de las lesiones, aportando su estímulo proliferativo y su acción antiapoptótica.
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NOTAS AL PIE DE PÁGINA | |
Correspondencia: José Javier Gómez-Román. Departamento de Anatomía Patológica. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Instituto Nacional de la Salud. Santander, España. mailto:apagrj@humv.es |