Cuba

Introducción: En oncología la utilización de marcadores tumorales con valor pronóstico y predictivo de respuesta a la terapia hacen mas selectiva y efectiva la utilización de las drogas antitumorales, tal es el caso del Receptor de Estrógeno, el cual tiene un valor pronóstico e influye en las decisiones terapéuticas a seguir con las pacientes de cáncer de mama. La presencia del receptor de estrógeno en las muestras de tejido neoplásico, no sólo es un elemento a favor de una mejor evolución clínica sino de una mayor probabilidad de respuesta a la hormonoterapia.
Objetivos: Determinar la presencia del receptor de estrógeno por Inmunohistoquímica, en una muestra de pacientes con cáncer de mama procedentes de 5 provincias del país y comparar el porciento de expresión del receptor con el que se obtuvo en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología en 1988 a través del método bioquímico, al estudiar un número similar de pacientes.
Materiales y Métodos: Se realizó la determinación Inmunohistoquímica del receptor de Estrógeno en 365 pacientes con cáncer de mama. Se utilizaron fragmentos de tejidos incluidos en formalina y embebidos en parafina de los Departamentos de Anatomía Patológica de las 5 provincias y se empleó un anticuerpo monoclonal anti-receptor de estrógeno y un sistema de detección ultra sensible de estreptavidina- biotina- peroxidasa, ambos de Anacrom Diagnósticos.
Conclusiones: En nuestra muestra encontramos una positividad de un 41, 09 % para el receptor, ligeramente menor que el reportado por Pascual M.R, et al en 1988 que refirió un 54 %.

En el cáncer la utilización de marcadores tumorales con valor pronóstico y predictivo de respuesta a la terapia hacen mas selectiva y efectiva la utilización de las drogas anticancerosas, tal es el caso del Receptor de Estrógeno (RE), el cual tiene un valor pronóstico e influye en las decisiones terapéuticas a seguir con las pacientes de cáncer de mama(1,2,3). La presencia de RE en las muestras de tejido neoplásico no sólo es un elemento a favor de una mejor evolución clínica o, lo que es lo mismo, de una mayor sobrevida libre de eventos y de un incremento en la sobrevida global, sino que además las pacientes con RE positivos tienen mayor probabilidad de respuesta a la hormonoterapia. Su expresión oscila entre 50 al 85% en los tumores de mama(4-5).
En 1972 se empezaron a dosificar los RE en Cuba mediante el empleo de métodos bioquímicos usándose la técnica de carbón cubierto con dextrán seguida de ploteo Scatchard(6,7), el método de enfoque isoeléctrico(8,9,10) y el gradiente de densidad de sacarosa. En nuestro país, en el Instituto de Oncología y Radiobiología de la Ciudad de la Habana y en el Hospital Oncológico de Santiago de Cuba se utilizó esta tecnología durante casi dos décadas.
Este método tiene considerables desventajas, ya que se requiere del empleo de hormonas radioactivas, de gran cantidad de muestra a procesar, de equipamiento costoso y, en algunas ocasiones, la misma técnica afecta la estructura del receptor(11).
En la década de los 80 se desarrollaron métodos inmunohistoquímicos (IHQ) para la detección de los RE(12-13), que se basan en el reconocimiento del receptor mediante el uso de anticuerpos monoclonales, proporcionando un diagnóstico rápido y de alta sensibilidad.

La determinación Inmunohistoquímica (IHQ) del RE se realizó en 365 pacientes con cáncer de mama provenientes de diferentes centros hospitalarios de 5 provincias del país, Pinar del Río, Ciudad Habana, Villa Clara, Camaguey y Holguín.
Se utilizaron fragmentos de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina de los Departamentos de Anatomía Patológica. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-RE, como sistema de detección un kit MLINK ultrasensible de Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa y un kit de 3,3' diaminobencidina Tetrahidrocloridrica (DAB) para el revelado, todos los reactivos fueron de Anacrom Diagnosticos, S.L.

Se realizaron 2 cortes de 4 micras para cada caso, se montaron sobre láminas silanizadas y se incubaron a 68oC durante 12 horas.
Los cortes de tejidos fueron desparafinados en xilol e hidratados en etanol a concentraciones decrecientes, aclarados durante 5 minutos (min) en H2O bidestilada y lavados en solución salina tamponada con fosfatos (SSTF).
El desenmascaramiento antigénico del RE, se realizó hirviendo las láminas en buffer citrato pH 6,8 durante 10 min, utilizando un horno microondas. Los cortes se dejaron enfriar durante 20 min, se lavan con agua destilada y posteriormente en solución SSTF.
La peroxidasa endógena se inhibió con una solución de H2O2 al 3% durante 5 min a temperatura ambiente (TA), se lavó con SSTF, aplicándose el anticuerpo anti-RE y el control negativo durante 30 min a TA, después del lavado se aplicó el anticuerpo biotinilado 10 min, se lavó con SSTF y se añadió el complejo estreptavidina-peroxidasa igual tiempo y a TA, finalmente las secciones de tejido se incubaron con una mezcla fresca de solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB) en 1ml de buffer sustrato durante 3 a 5 min.
El contraste se realizó con Hematoxilina de Mayer, se procedió a la deshidratación en alcoholes a concentraciones ascendentes, clarificándose en xilol y finalmente se montó en medio permanente Eukitt (Kinder GmbH & CO).
En cada experimento realizado se usó de control un tejido RE positivo.
La evaluación se realizó de forma semicuantitativa utilizando un microscopio de luz blanca (Leica)

En 1988 en nuestro Instituto de Oncología Pascual M.R., et al14 estudiaron la expresión del RE en una serie de 403 pacientes con cáncer de mama, a través de métodos bioquímicos empleando la técnica de carbón recubierto con dextrán, encontrando un 54% de pacientes RE+ y 43% RE-.
Pinar del Río. 67 pacientes estudiados, el 25% RE+ y el 42% RE-, 37% de positividad.
Ciudad Habana. 61 pacientes estudiados, 39 RE+ y 22 RE-, 64% de positividad.
Villa Clara. 111 pacientes estudiados, 55 RE+ y 56 RE-, 49% de positividad.
Camaguey 75 pacientes estudiados, 16 RE+ y 59 RE-, 21% de positividad.
Holguín. 51 pacientes estudiados, 15 pacientes RE+ y 36 RE-, 29% de positividad.
En nuestro estudio de los 365 pacientes analizados, 150 fueron RE+, lo que representa un 41% y 215 resultaron RE- para un 59%.

Numerosos estudios han demostrado una buena correlación entre ambos métodos6,8.Las diferencias en los resultados obtenidos a través de ambos métodos pudieran correlacionarse con:
*Las características de las muestras empleadas, en el caso del método del carbón recubierto con dextrán, se utilizan tejidos frescos, y para la Inmunohistoquímica fragmentos de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina.
*Forma de cuantificación del RE:
Carbón recubierto con Dextrán. Cuantitativa partiendo de un macerado de todo el fragmento tumoral, que conlleva a la pérdida de la integridad celular.
Inmunohistoquímica. Semicuantitativa a través de la visualización directa de la coloración nuclear en las secciones de tejidos.
Podrían estas diferencias dar una explicación al hecho de que en nuestro estudio el por ciento de positividad al RE sea ligeramente menor.


Las diferentes condiciones en que fueron fijadas y procesadas estas muestras en cada uno de los centros incluidos en este estudio, en diferentes años y sin criterio de que serían utilizadas para determinaciones inmunohistoquímicas, podrían influir en la conservación de los antígenos, ocurriendo la pérdida de los mismos y resultando en la obtención de un mayor número de posibles falsos negativos, lo que pudiera explicar la disminución en el % de positividad en nuestra muestra, al compararla con los resultados anteriores derivados de la realización de la determinación del RE a través del método bioquímico.

En nuestro caso, las condiciones en que fueron fijadas y procesadas estas muestras procedentes de diferentes centros, con diferente calidad , en diferentes años y sin criterio de que serian utilizados para determinaciones por IHQ , podría influir en la conservación de los antígenos, pudiendo ocurrir la pérdida de los mismos y dando como resultado la obtención de un mayor numero de falsos negativos

En la Fig.1 se observa el reconocimiento del AcM anti RE.

1. Mc Guire WL, Clark GM, Dressler LG, Owens MA. Role of steroid hormone receptors as pronostic factors in primary breast cancer. NCI Monographs. 1:19-23, 1986
2. Rose C, Thorpe SM, Andersen KW, et al. Beneficial effect of adjuvant tamoxifen therapy in primary breast cancer patients with high oestrogen receptor values. Lancet ; 1:16-9, 1985
3. Stewart HJ, Prescott R. Adjuvant tamoxifen therapy and receptors levels. Lancet. 1:573, 1985
4. Pascual M.R. Determinación de receptores hormonales de tumores mamarios humanos. Rev Cub Obstet Ginecol 7:1, 1981.
5. Reiner A. et al. Immunocytochemical localization of estrogen and progesterone receptor and prognosis in human primary breast cancer. Cancer Res 50:7057, 1990.
6. Scatchard G: The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann NY Acad Sci 51:660-672, 1949
7. Chamness GC and McGuire WL: Scatchard plots: common errors in correction and interpretation. Steroids 26(4): 538-542, 1975
8.Wrange Ö, Nordenskjöld B, Silfverswärd C, Granberg PO and Gustafsson J-A: isoelectric focusing of estradiol receptor protein from human mamary carcinoma - a comparison to sucrose gradient analysis. European Journal of cancer 12: 695-700, 1976.
9.Wrange Ö, Nordenskjöld B and Gustafsson J-A. Cytosol estradiol rceptor in human mammary carcinoma: an assay based on isoelectric focusing in polyacrylamide gel. Analytical Biochemistry 85: 461-475, 1978.
10.Wrange Ö, Humla S, Ramberg I, Gustafsson S, Skoog L, Nordenskjöld B and Gustafsson J-A: Progestin-receptor analysis in human breast cancer cytosol by isoelectric focusing in slabs of polyacrilamide gel. Journal of Steroid Biochemistry 14: 141-148, 1981.
11. .Mårten Ferno, Åke Borg and Allan Norgren. A comparison of two steroid receptor assays in breast cancer: Dextran coated charcoal and isoelectric focusing. Anticancer Research. 3:243-246, 1983.
12. Jensen E.V. et al. Receptors reconsidered: a 20 year perspective. Rec Prog Horm Res 38:1, 1982.
13. Greene G. and Press M.F. “Immunochemical Evaluation of Estrogen Receptor and Progesterone Receptor in Breast Cancer” En: Immunological Approaches to the Diagnosis and Therapy of Breast Cancer. Ed. R Cerani. Plenum Publishing Corp.; New York, pp. 119-135, 1987.
14. Pascual M.R. Factores clínicos y bioquímicos en el pronóstico del cáncer de mama. Tesis para optar por el grado de Doctor en Ciencias. INOR, sept. 1988.

15. King W. J, DeSombre E.R, Jensen E. D, Greene J. L. comparison of immunocytochemical and steroid – binding assays for estrogen receptor in human breast tumors. Cancer Res 1985; 45:293- 304.
16. Pertschuk L. P, Einsenberg K. B, Carter A.C, Feldman J.G. Immunohistologic localization of estrogen receptors in breast cancer with monoclonal antibodies. Correlation with biochemistry and clinical endocrine response. Cancer 1985; 55:1513- 1518.
17. Sondegaard G, Pedersen K.O , Paulsen S.M. Estrogen receptor analyses in breast cancer: comparison of monoclonal immunohistochemical and biochemical methods . Eur. J. Cancer Clin. Oncol 1989; 25: 1425- 1429.

El 8/3/2004 19:37, Abel Ernesto Gil Díaz dijo: