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Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.

Lic. Irina Hernández Melendi , Téc. Eduardo Boix Valdés y Téc. Ernesto Wilson Batista

Departamento de Anatomía Patológica Hospital Pediátrico Docente "Juan Manuel Márquez"

Cuba
 Resumen
Objetivo: Mostrar la utilidad de las Técnicas Histológicas y la Microscopía Electrónica en el diagnóstico de las enfermedades musculares.

Material y Método: A partir del año 1990 en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Pediátrico “Juan Manuel Márquez”, se comenzaron a procesar las biopsias de músculo estriado esquelético de pacientes ingresados en el Servicio de neuropediatría. Las muestras de tejido llegan al departamento en fresco para ser estudiadas por congelación y tomar los fragmentos necesarios para el estudio por microscopía electrónica y por parafina. A los cortes obtenidos en el criostato se les realizaron las técnicas de hematoxilina y eosina, PAS, Tricrómica de Gomori modificada, NADH y ATPasa.

Resultados: La técnica de Hematoxilina y Eosina informa las características morfológicas generales del espécimen, observándose el núcleo azul y el citoplasma rosado. Con la técnica ATPasa se diferencian las fibras tipo 1 y 2, el color de la reacción será según el pH utilizado. El NADH identifica los acúmulos de mitocondrias y la anatomía intermiofibrilar, observándose depósitos granulares de color azul. Con el PAS se demuestra el glucógeno en las fibras en diferentes tonos de magenta. La Tricrómica de Gomory modificada tiñe las fibras de azul verdoso, las mitocondrias de rojo, el tejido conectivo fibroso endomisial verde y los núcleos rojo marrón. Con la microscopía electrónica observamos en un caso diagnosticado como miopatía mitocondrial, mitocondrias en forma de anillo cargadas de glucógeno y crestas dispuestas longitudinalmente.

Conclusiones: Las técnicas enzimáticas, especiales y la microscopía electrónica son de gran utilidad en el diagnóstico de las enfermedades musculares. A través de ellas se pueden identificar los distintos tipos de fibras musculares, las alteraciones estructurales en distintas patologías, observar trastornos del glucógeno y almacenamiento de otras sustancias y además se pueden estudiar los daños a nivel ultraestructural en diferentes miopatías.
 Introducción

La patología neuromuscular abarca una constelación de enfermedades que requieren para su diagnóstico la suma de los hallazgos clínicos, enzimáticos, electromiográficos y microscópicos. (1 2)
La biopsia muscular ha mostrado ser uno de los pilares en el diagnóstico de muchas de estas enfermedades, por lo que se recomienda como método de estudio en la mayoría de los casos. Esta no es una urgencia y se debe planificar para preparar el procesamiento técnico necesario, el cual tiene particularidades que lo distinguen del manejo de las biopsias procedentes de otros sitios. (3)
En nuestro Trabajo se describe el procedimiento técnico a seguir con las biopsias musculares al llegar al Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Pediátrico “Juan Manuel Márquez” y se realiza una descripción de los aspectos morfológicos que se observan con las técnicas histoquímicas: ATPasa, NADH-tr, Tricrómica de Gomory modificada, PAS y del procesamiento para estudio ultramicroscópico; las cuales son de gran utilidad para emitir un diagnóstico relativo a la normalidad o clasificación de la enfermedad neuromuscular, lo que demuestra la efectividad de estas técnicas en su conjunto.
 Material y Métodos

A partir del año 1990 se comenzaron a procesar en nuestro Laboratorio las biopsias de músculo estriado esquelético de los pacientes ingresados en el Servicio de Neuropediatría.
Las muestras de tejido llegan al Departamento en una gasa húmeda con solución salina fisiológica y lo más rápido posible después de ser tomadas en el salón de operaciones. Inmediatamente el técnico la observa con un microscopio estereoscópico para orientar las fibras musculares y dar los cortes pertinentes, obteniendo 3 fragmentos para realizar las diferentes técnicas.
Un fragmento se fija en Glutaraldehido al 3,2 % para realizar la técnica de microscopía electrónica si fuera necesario. Otro es fijado en formol neutro para realizarle el proceso convencional por parafina y otras técnicas que necesite el especialista. El tercer fragmento se coloca en una cápsula de biopsia a la cual previamente se le añade talco y con el que terminamos de cubrir la muestra y se introduce en el nitrógeno líquido; a dicho fragmento se le realizan cortes seriados en un criostato para hacer las técnicas de Hematoxilina y Eosina, ácido periódico de Schiff (PAS), Tricrómica de Gomory modificada, NADH-tr y ATPasa.
Los resultados se presentarán a través de imágenes, para de esta forma ayudar a su comprensión.
 Resultados

La técnica de Hematoxilina y Eosina pone de manifiesto características morfológicas generales y aspectos arquitecturales del espécimen estudiado, explora la forma y tamaño de las fibras, situación de los núcleos y estado del sarcoplasma. Se observa el núcleo de color azul y el citoplasma rosado.
Con la técnica ATPasa a pH 9.4 las fibras tipo I son claras, mientras que las tipo IIa y IIb son oscuras. A pH 4.6, las fibras tipo I y IIb son oscuras, mientras que las tipo IIa son claras. A pH 4.3 se consigue una imagen en negativo de la primera, o sea, las fibras tipo I son oscuras mientras que las tipo II son claras.
En la Fig_1 mostramos un caso diagnosticado como Werdnig-Hoffmann, donde la técnica ATPasa a pH 9.4 pone de manifiesto las fibras tipo I de color claro y las fibras tipo II de color oscuro.
La técnica de NADH-tr expresa el producto de la reacción como depósitos granulares azules en la fibra muscular, excepto en zonas ocupadas por los núcleos subsarcolémicos.
En la Fig_2 se observa un caso de miopatía congénita “central core”, donde esta técnica fue muy útil para demostrar la malla miofibrilar de color azul, dejando al descubierto la zona anormal del core.
La reacción ácido periódico de Schiff (PAS) demuestra el contenido de glucógeno en cada tipo de fibra, permite distinguir las fibras I rosa pálido de las tipó II que son rosa intenso. Se observa la malla intermiofibrilar y se dibuja la membrana sarcolemal y la membrana basal.
En la Fig_3 mostramos un caso de miopatía congénita “central core” donde con el PAS la malla miofibrilar se coloreó de color magenta y la zona anormal del core de color rosa claro.
La Tricrómica de Gomory modificada también pone de manifiesto características generales de la muestra, explora la malla intermiofibrilar, tiñe el sarcoplasma de azul verdoso, el tejido conectivo de color verde, los acúmulos de mitocondrias y los núcleos de color rojo. Además se demuestran fácilmente las fibras hialinas y necróticas, así como inclusiones intrasarcoplásmicas.
En la Fig_4 se muestra un caso de miopatía mitocondrial donde se observan fibras irregulares, acúmulos de mitocondrias y fibras rasgadas de color rojo.
Con la microscopía electrónica se observan las alteraciones a nivel ultraestructural. En la Fig_5 se muestra un caso diagnosticado como miopatía mitocondrial en el que se observan mitocondrias en forma de anillo cargados de glucógeno y disposición de las crestas en forma longitudinal.

Imagen de Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.Zoom
ATPasa a pH 9.4
Imagen de Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.Zoom
NADH-tr
Imagen de Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.Zoom
Reacción ácido periodico de Schiff.
Imagen de Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.Zoom
Tricrómica de Gomory modificada.
Imagen de Aplicación de la histoquímica y la microscopía electrónica en las enfermedades musculares.Zoom
Microscopía electrónica.
 Discusión

La biopsia de músculo estriado esquelético es importante realizarla para el diagnóstico específico de las enfermedades neuromusculares.
Podemos asegurar que nuestro centro es el único Hospital Pediátrico en el país en el que están disponibles estas técnicas, por lo que aspiramos que este trabajo sirva de estímulo a otros laboratorios de patología cubanos.
Es importante hacer algunas consideraciones con relación al desarrollo de las técnicas enzimáticas, poco desarrolladas en nuestro medio, así como algunas particularidades en el procedimiento técnico, donde coincidimos con otros autores.
El primer cuidado es que la muestra se debe transportar fresca, en un ambiente húmedo con solución fisiológica para garantizar la calidad de los estudios histoquímicos, seguido de la buena orientación y corte transversal del fragmento para facilitar la identificación de los diferentes tipos de fibras (4 5 6)
Para la fijación en nitrógeno líquido nosotros utilizamos cápsulas metálicas de biopsias rellenas de talco, donde colocamos el fragmento de tejido y de esta forma hemos logrado una conservación uniforme del tejido sin que se produzcan artefactos de fijación.
En estas biopsias de músculo, la técnica de Hematoxilina y Eosina es más sensible porque al conservar la muestra de la manera que describimos anteriormente, se logra conservar íntegra la estructura de la fibra muscular, libre de los artefactos que pueden producir algunas soluciones fijadoras de tejido.
La clasificación internacional de las fibras musculares I y II está basada en la técnica ATPasa, la cual es muy útil para determinar si hay agrupamiento de fibras y cuál tipo de fibra se ha dañado predominantemente, ya que se establece una diferenciación entre las fibras tipo I y tipo II de acuerdo a la intensidad de la reacción según el pH utilizado. Al realizar esta técnica se debe tener mucho cuidado en la preparación de las soluciones porque alteraciones del pH pueden conducir a resultados totalmente diferentes. (4 7 8)
La técnica de NADH-tr es de gran valor para demostrar la actividad enzimática oxidativa mitocondrial, mostrando acúmulos de mitocondrias en diferentes localizaciones de la fibra muscular. En el caso de una miopatía mitocondrial se aprecian acúmulos de mitocondrias subsarcolémicas, lo cual se confirma con la microscopía electrónica. En la miopatía congénita “central core” permite observar la zona dañada como unos espacios claros. Es importante al realizar esta técnica ser muy cuidadosos al preparar el medio de incubación, cuidando el pH y la temperatura adecuada para lograr los buenos resultados. (4 5 6 7 8)
Con el PAS, en nuestro laboratorio, además de utilizarlo como en otros países (4) para observar trastornos del glucógeno e identificar los tipos de fibras, logramos demostrar la zona dañada en la fibra muscular, en la miopatía “central core” al realizar una modificación en la preparación del reactivo de Schiff.
Nuestros resultados con la Tricrómica de Gomory modificada han coincidido con otros autores (3)
La microscopía electrónica es un método de elección en algunas enfermedades neuromusculares en las que el daño solamente se puede observar a nivel ultraestructural, nosotros según el diagnóstico clínico presuntivo del médico de asistencia y el criterio del patólogo, continuamos el proceso después de la fijación en glutaraldehido al 3,2 %, en los casos en que no fue suficiente con las coloraciones de rutina, especiales e histoquímica enzimática para llegar al diagnóstico final.
 Bibliografia

1. Anderson J.R. Patología de Muirs. Vol.II. Editorial Científico-Técnica. Ciudad de la Habana. Cuba. 1989. Pág 1071.
2. Rosai J. Ackerman. Patología quirúrgica. Tomo I. Edición Revolucionaria. Editorial Científico-Técnica. Ciudad de la Habana. Cuba. 1985. Pág. 164-171.
3. Ramzi S. Cotran, Vinay Kumar y Tucker Collins. Patología Estructural y Funcional de Robbins S.L. Sexta Edición. España. 1999. Pág. 1318-1334.
4. Fernández-Díez J. Histología del músculo para patólogos. Patología 1991. Vol 29, pp 39-53.
5. Carpenter S, Karpati G. Pathology of skeletal muscle. Edit Churchill Livingstone, 1984. Pag 39-61, 453, 484-504, 603.
6. Swasch M, Martin S. Biopsy pathology of muscle. Laboratory Methods. London 1990. Pag 34-45, 95-102, 130.
7. Barka T y Anderson P.J. Histoquímica. Editora ATIKA. S.A. Madrid 1967. Pág. 82, 359-363.
8. Spannhof L. Histoquímica práctica. Zaragoza. España. Editorial Acribia. 1966. Pág. 124-160.

 Comentarios

El 11/3/2004 23:00, Joan Corbera dijo:

Me imagino que actualmente para descartar patologías mitocondriales también usáis otras tècnicas enzimohistoquímicas como la SDH,COX y ATP Sintetasa.

El 15/3/2004 20:16, Irina Hernández Melendi dijo:

Realmente no podemos hacer esas técnicas que ud. menciona por no contar con los reactivos necesarios. Ojalá pudiéramos utilizarlas para descartar miopatías mitocondriales.

El 16/3/2004 19:42, Irina Hernández Melendi dijo:

Sr. Joan Corbera, aunque no contamos en estos momentos con los reactivos, quisieramos si es posible, nos envíe el procedimiento de las técnicas que usted menciona a la siguiente dirección de correo:rene.millares@infomed.sld.cu

El 18/3/2004 23:01, Joan Corbera dijo:

Tanto la técnica del SDH(succinato dehidrogenasa) como la del COX(citocromo-c oxidasa) son relativamente fáciles de realizar con el protocolo adecuado y los reactivos pertinentes. Son tècnicas enzimohistoquímicas como lo es el NADH que ya utilizan en su laboratorio. En cuanto a la ATP sintetasa, dicha técnica requiere más tiempo y concentración que las ya mencionadas. En cuanto me sea posible les pasaré las mismas por correo electrónico a la dirección mencionada. Si quiere tener un contacto más directo conmigo, le dejo mi e-mail(corbemon@ya.com) y el teléfono del hospital donde trabajo en Barcelona (932532145 extensión 2160- Joan Corbera)Encantado en ofrecerles toda la información necesaria!!!!

El 24/3/2004 12:08, LIC:ISABEL BROWN dijo:

MUCHAS FELICIDADES AL COLECTIVO, YA QUE ES UN TRABAJO MUY BIEN REALIZADO.

ISABEL BROWN(INOR)

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