Chile

Los significativos avances de la inmunohistoquímica permiten diferenciar tumores que previamente eran considerados como leiomiomas o leiomiosarcomas, contrastándolos con los caracteres histopatológicos de estos. La incorporación del anticuerpo c-kit (CD-117) apoya esa diferenciación y permite darles la designación de tumores estromales gastrointestinales (GIST).

En este estudio se presenta una actualización de la experiencia obtenida en esta patología, ampliando la serie a 10 casos de GIST, previamente diagnosticados a los cuales se les aplicó el anticuerpo primario para c-kit (CD 117). Las muestras fueron posteriormente reveladas con complejo avidina-biotina y se evaluaron según su reacción a la inmunotinción como positivas o negativas.

Los resultados obtenidos se expresan cualitativamente de acuerdo a la marcación e intensidad de la reacción, observándose una manifiesta diferencia entre las muestras provenientes de biopsias endoscópicas, con baja o nula reactividad, de aquellas en que los tumores son de piezas operatorias mayores.

La aplicación del anticuerpo c-kit (CD117) en los procedimientos inmunohistoquímicos de rutina en la diferenciación de los tumores estromales digestivos, constituye un avance recomendable para el diagnóstico de estas lesiones.

Los tumores malignos del estroma gastrointestinal de origen mesenquimatoso progresan rápidamente(1,2,3,4) y hasta no hace mucho existió una extremada confusión y controversia acerca de la clasificación, diferenciación y pronóstico de estos, la que sólo hacia finales de 1998 tuvo un cambio importante en la interpretación de dichas lesiones debido fundamentalmente a los aportes de la inmunohistoquímica, de la microscopía electrónica, de la biología molecular y de los estudios de la histogénesis de ellos, dado que dichos caracteres parecían indicar que estos tumores, considerados de acuerdo a las clasificaciones existentes como leiomiomas o leiomiosarcomas, explicarían su expresión mioide incompleta y variable diferenciación neural a su origen en las células intersticiales de Cajal (CIC) o sus precursores.(5-10) Esta característica permitiría diferenciarlos de otros tumores del tracto digestivo y darles la designación de tumores estromales gastrointestinales (GIST).(11-18)

Los GIST son tumores mesenquimatosos comunes del tracto gastrointestinal; histológicamente son neoplasias de células fusiformes (70%), epitelioides (20%, ubicado fundamentalmente en el estómago) o de tipo mixto, que deben ser diferenciados de otros tumores con histología similar como: fibromatosis (tumor desmoide), miofibroblastoma inflamatorio, leiomioma, leiomiosarcoma, neuroma, neurosarcoma, mesotelioma sarcomatoide, carcinosarcoma, y angiosarcoma.

El primer indicio hacia una mejor comprensión patológica del GIST provino de un estudio(19) en el cual se demostró que 46/49 (94%) de los GIST humanos eran positivos para la proteína KIT por inmunohistoquímica. En 5/6 GIST, en los que se determinó la secuencia del gen KIT, se encontraron mutaciones somáticas activas en forma constitutiva. Las únicas células del tracto gastrointestinal que normalmente expresan KIT (CD117) son las células intersticiales de Cajal, por lo que se cree que los GIST se originan a partir de estas células o comparten un precursor común con las mismas. Las células intersticiales de Cajal funcionan como células marcapaso del intestino, coordinando la peristalsis y requieren expresión y función normal del receptor tirosina kinasa KIT para su desarrollo.

El c-kit (CD117) es un protooncogen, homólogo del oncogen v-kit del virus sarcoma HZ4 felino. En el ser humano se encuentra localizado en el cromosoma 4 (q11-21; locus W) que codifica una proteína tirosina kinasa de tipo III receptora de transmembrana, de 145 kD, perteneciente a la familia que incluye a los receptores de PDGF, M-CSF y el ligando de FLT3, esto significa que es estructuralmente similar al receptor para factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y al factor estimulante de colonias (CSF)(15,20-27).

Existe una marcada evidencia de que la expresión del c-kit tiene especial relevancia en variados aspectos de la hematopoyesis normal (de ahí su relación con CD34) siendo esencial para su desarrollo; en la proliferación y migración de las células germinales primordiales y melanoblásticas durante la embriogénesis (procesos de espermatogénesis y melanogénesis), e igualmente responsable del desarrollo de las células intersticiales de Cajal (CIC)(6,20,28).

Por lo tanto, se expresa en una amplia variedad de tipos celulares normales, incluyendo mastocitos, melanocitos y células epiteliales de las glándulas salivales, tracto gastrointestinal, riñón y de la glándula tiroídea. Existe asímismo una fuerte positividad de la inmunoreacción en tejidos hematopoyéticos, células gliales fetales y adultas, y en las células ductales mamarias (siendo las mioepiteliales negativas). Además, las células medulares de las suprarrenales muestran una fuerte tinción nuclear(21).

Es importante, por tanto -en condiciones normales- en la hematopoyesis, melanogénesis, gametogénesis, el desarrollo de las células intersticiales de Cajal y en el crecimiento y diferenciación de los mastocitos. Su activación estimula el crecimiento y la supervivencia celular a través de varias vías (MAP kinasas, PI3 kinasa y STAT). Normalmente, KIT existe como una proteína monomérica de transmembrana, que luego de unirse a su ligando, el factor de células madre (Stem Cell Factor, SCF) dimérico, se dimeriza. Las dos moléculas de KIT unidas se autofosforilan en el ambiente de los residuos de tirosina. Estos sitios fosforilados, a su vez se unen a otras kinasas o proteínas adaptativas que median la transmisión de señales intracelulares.

La frecuencia de mutaciones somáticas de KIT en los GIST oscila entre 20% y 92% y serían estas mutaciones las que darían como resultado la activación independiente del ligando de la actividad de tirosina kinasa de éste, produciendo su dimerización espontánea y la activación de las citadas vías de transmisión de señales. Estudios recientes han encontrado mutaciones de KIT en 85-90% de los casos de GIST en 4 regiones distintas: exones 9 (15%), 11 (70-75%), 13 (2%), y 17 (2%),(29-32) dándose con similar frecuencia en tumores benignos o malignos, con estadios de tipo precoz, localizados o metastásicos, por lo que se debe considerar que todos los GIST poseen potencial para malignizarse en un determinado lapso de tiempo(2,3,33,34).

Los cariotipos evidencian pérdida de los cromosomas 14 y 22, lo que estaría sugiriendo la existencia de genes supresores tumorales en estos cromosomas. Además, los GIST benignos y malignos se encontrarían en continuidad biológica, dado que la progresión de un estadio a otro se acompaña de la adquisición progresiva de alteraciones citogenéticas características siguiendo este esquema general: mutación activadora de KIT->deleción de 14q->deleción de 22q-> deleción de 1p->ganancia de 8q->deleción de 11p->deleción de 9p->ganancia de 17p; (29-32) aunque hay que tener presente que no todos los GIST evolucionan en este mismo orden, pero siempre las mutaciones de KIT son previas a las aberraciones descritas.

Esta evidencia, junto a la existencia de informes de familias con múltiples GIST que tienen mutaciones activadoras de KIT en la línea germinal (todas las células de los individuos expresan KIT mutado), apoyaría la hipótesis de que la activación oncogénica de KIT es el inicio en la patogénesis del GIST. Es posible demostrar evidencia bioquímica de activación de KIT en prácticamente todos los GIST, incluso en los que carecen de una mutación detectable.

La inmunohistoquímica (IHQ) ha sido de especial ayuda en la diferenciación de estos tumores(35-38). La introducción de un nuevo anticuerpo, el c-kit (CD117)(20, 39-44), frecuentemente asociado al CD34 (marcador hematopoyético y de células del endotelio vascular) que está presente en leioimiosarcomas, sarcomas de células escamosas y sarcomas epitelioides(43,45-49), presenta un patrón de marcación común a las células de Cajal, por lo que los tumores estromales gastrointestinales (GIST) en la mayoría de los casos son fuertemente c-kit (CD117) positivos, lo que permite su clasificación como tumores mesenquimáticos del tracto gastrointestinal.

A consecuencia de esto, varios autores(5-10) consideran que las CIC son las células que dan origen a estas neoplasias. Sin embargo, hay tumores fuera del tracto gastrointestinal (tumores estromales extragastrointestinales) con similar histopatología que son positivas para este anticuerpo y en donde normalmente no existen dichas células(50,51,52).

El criterio diagnóstico clave para los GIST es la inmunopositividad para c-Kit (CD117). La inmunotinción con este anticuerpo puede dar como resultado distintos tipos de presentación: difuso, citoplasmático fuerte, moteado o membranosos. Estos patrones de tinción podrían estar a su vez reflejando los distintos tipos de mutaciones. El anticuerpo c-kit permite la identificación de un producto génico de 145 kD que se encuentra inserto en la membrana plasmática celular de las células del glioblastoma humano y también se han reconocido por IHQ productos génicos del c-kit en varios tumores sólidos humanos. También ha sido descrito como positivo en angiosarcomas y ocasionalmente, en casos de sarcoma de Kaposi.

Cuando las características histológicas y la presentación clínica de un tumor gastrointestinal son consistentes con GIST, la tinción positiva para c-Kit (CD117) confirma el diagnóstico, debido a que la mayoría de los GIST (más del 95%) expresan el receptor c-Kit tirosina kinasa, siendo esto reconocido como marcador primario de diagnóstico para este tipo de tumores(1,34).

No obstante la inmunorreacción positiva para c-Kit por sí misma no es diagnóstica de GIST, dado que otros tumores pueden también en ocasiones expresarlo(50,51,52), es recomendable utilizar algoritmos que incluyan otros marcadores simultáneamente para el diagnóstico diferencial. Entre estos anticuerpos se encuentran:

· CD34: es un marcador asociado más frecuentemente con células hematopoyéticas o del endotelio vascular(28,45-49). CD34 es positivo en el 60-70% de los GIST, pero como lo expresan también otros tumores, no es específico para estos.
· Desmina y Actina: son dos proteínas encontradas en tumores de músculo liso (leiomiomas, leiomiosarcomas)(53,54,55) y que generalmente no se encuentran en los GIST. La tinción con c-Kit (CD117), desmina y actina (SMA) permite diferenciar sarcomas de músculo liso de GIST con apariencia de tumores de músculo liso.
· S-100/ENE: son proteínas presentes en tumores que se derivan de la cresta neural (schwannoma), pero que no están en aquellos GIST con apariencia neural(56).

Lo anterior concuerda con nuestra experiencia en estudios previos(57), tanto en tumores gástricos (Tabla 1), como en los de origen muscular (Tabla 2).

TABLA 1
CASOS	DESMINA	CD34	ENE	c-kit
1	(-)	(+)	(+)	(+)
2	(-)	(+)	(-)	(+)
3	(-)	(+)	(-)	(+)
4	(-)	(+)	(-)	(+)
5	(-)	(+)	(-)	(-)

En esta Tabla se observó una clara inmunoreacción negativa para Desmina en todas las muestras, en tanto que con ENE sólo 4 fueron negativas y 1 positiva. Para CD34 la inmunoreacción fue en todos los casos positiva y para c-kit fue positiva en 4/5 casos. El resultado negativo para c-Kit en 1 de los casos, correspondió a una biopsia endoscópica y podría ser atribuible a lo escasa de la muestra o a que no se tomó de la zona más representativa o tumoral, lo cual también estaba descrito en la literatura.

TABLA 2
CASOS	DESMINA	CD34	ENE	c-kit
1	(+++)	(+)	(+)	(-)
2	(+++)	(+)	(+)	(-)
3	(+++)	(+)	(+)	(-)

La inmunoreacción mostrada por todas las muestras destacaba, en el caso de los tumores musculares, a la Desmina por ser fuertemente (+), en tanto que para CD34 la positividad era exclusiva de patrón vascular, para ENE era difusa y para c-kit era absolutamente negativa.

Por otra parte, estudios muestran que el 56% de los carcinomas de células pequeñas del pulmón y el 75% de los de células grandes, presentan reacción positiva al c-kit, en tanto que carcinomas escamosos y adenocarcinomas muestran una pobre o baja reactividad (19%) y en tejidos pulmonares fetales y adultos no ha sido observada. Algunos resultados sugieren que los productos génicos del c-kit pueden estar relacionados con los procesos de transformación maligna y patogénesis de algunos tipos específicos de tumores humanos sólidos, como los de células pequeñas del pulmón(58,59). Contrariamente, c-kit es altamente positivo en glándula mamaria, aunque bajo en cánceres de mama. Este patrón IHQ, unido a caracteres ultraestructurales, contrasta con los de otros tumores de estirpe mioide ubicados en útero, recto y tejidos blandos.

En nuestra experiencia, esta patología es infrecuente dado que a lo largo de 20 años hemos reunido sólo 19 casos en una casuística de 40.000 biopsias, de los cuales 14 fueron considerados benignos y 5 de carácter maligno, considerando tamaño, multiplicidad y número de mitosis, y evolución clínica, lo cual implicaría que se presentaría aproximadamente un caso por año y cada 3-4 años uno de ellos sería de carácter maligno.

El propósito de este trabajo es el de ampliar nuestra casuística en este tipo de patología, mediante la aplicación del anticuerpo c-kit a tumores previa o contemporáneamente diagnosticados, de tal forma que hemos podido estudiar 10 de un total de 19 casos acumulados (históricos y recientes).

Biológico

- 10 muestras de tejido gástrico, previamente diagnosticadas como tumores de pared gástrica benignos y malignos, provenientes de igual número de pacientes, incluidas en parafina para procesamiento de rutina en histopatología.

Reactivos

- Formalina tamponada al 10%
- Anticuerpo Primario para c-kit (CD117) (Dako, A4502)
- Set revelador Avidina-Biotina-Complex, LSAB-2 (Dako, K0672)
- Buffer PBS, pH 7.2
- Agua destilada

Procedimientos

Los bloques de tejido, fijados e incluidos en parafina, se cortaron en micrótomo rotatorio con navajas desechables (Feather Co., Japón) a 5 µm de espesor y luego montados en portaobjetos silanizados. Los especimenes obtenidos fueron tratados con una solución de peróxido de hidrógeno al 5% (para inhibir la presencia de peroxidasa endógena), lavados con buffer PBS pH 7.2, incubados con el anticuerpo c-kit (CD117), revelados con avidina-biotina-complex (ABC) y la puesta en evidencia de la inmunoreacción fue realizada con el cromógeno de color rojo 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), se contrastaron con tinción de Hematoxilina y montados en medio hidrófilo permanente Faramount (Dako, S3025). Controles positivos y negativos de la reacción se realizaron en paralelo.(57)

Los resultados se denotan en cruces según la intensidad de la reacción y muestran que se obtuvo una positividad franca para c-kit (CD117), lo que demuestra lo planteado y corrobora lo descrito en la literatura (Tabla 3). Los resultados negativos para c-Kit en los casos 2 y 6, corresponden a biopsias endoscópicas y podrían ser atribuibles a lo escasa de la muestra. La negatividad del caso 4 corresponde a una muestra en la que no se tomó parte de la zona más representativa o afectada por el tumor, siendo esta también una biopsia endoscópica.

TABLA 3
CASOS	REACCION
1	(+)
2	(-)
3	(++)
4	(-)
5	(+)
6	(-)
7	(+)
8	(+)
9	(+)
10	(++)

Los tumores estromales gastrointestinales (GIST) son neoplasias mesenquimáticas comunes del estómago e intestino delgado, siendo menos frecuentes en otras partes del tracto digestivo. El poder diferenciarlos de leiomioma, leiomiosarcoma, schwannoma, desdiferenciaciones retroperitoneales de liposarcoma por invasiones locales de proximidad, tumores vasculares benignos y malignos, fibromatosis intraabdominal (tumor desmoide), carcinoide con morfología fusocelular y metástasis de melanomas o carcinoma fusocelular, es sumamente necesaria dado que estas son las patologías predominantemente frecuentes y la mayoría de estos tumores puede ser caracterizados a través de la información clínica y de la microscopía de rutina. La ubicación de los GIST tiene lugar en cualquier localización del tracto gastrointestinal tubular y en algunas localizaciones extragastrointestinales, aunque es mayoritariamente gástrica (50-60%), siguiéndole la de intestino delgado (20-30%), intestino grueso (10%), esófago (5%), y en menor frecuencia (5%) en otras ubicaciones de la anatomía(4,18,52).

Este antecedente es un importante factor pronóstico independientemente del tamaño tumoral, la tasa mitótica y la edad del paciente. Aunque no se ha comprobado fehacientemente, los localizados en el intestino delgado parecen ser los que tienen peor pronóstico. Generalmente son lesiones protruídas, con frecuente ulceración central y tienen el antecedente clínico de haber debutado con episodios hemorrágicos. Las biopsias endoscópicas pueden fracasar en el diagnóstico en primera instancia, por el origen submucoso de la lesión, con lo que se tiene un cuadro invasivo molesto para el paciente derivado de endoscopías y biopsias a repetición. El tamaño es notable, dado que no pocos de ellos son de más de 4 cms. y algunos se extienden como reloj de arena, alcanzando la subserosa, exhibiendo franca invasión del resto de los tejidos. En la histopatología convencional se describen 2 patrones morfológicos: uno fusocelular y otro epitelioideo(15,17,60).

Se considera que el 25-30% de los GIST son francamente malignos, de acuerdo con la presencia de metástasis y/o la invasión de órganos o estructuras adyacentes. El comportamiento del resto de estos tumores es bastante errático e impredecible. El riesgo es el enfoque más útil para poder evaluar su pronóstico, por lo que destacados patólogos a nivel mundial postulan que no hay que suponer a ningún GIST como benigno, y que en estos casos la clasificación de benigno o maligno debe ser reemplazada por la de bajo riesgo o la de potencial maligno incierto(59).

Poder separar a los GIST de los tumores de músculo liso verdaderos, es clínicamente relevante porque la conducta biológica de estos, como ya se ha señalado, puede resultar francamente difícil. Las determinaciones IHQ con c-Kit (CD117) positivas(6,15,40,57) pueden facilitar la distinción, dado que es muy raro que GIST sean CD117 (-) y que mostrando diferenciación mioide extrema no puedan ser detectables con técnicas corrientes, al igual que en los casos en que los GIST son S-100 (+) y CD117/CD34 (-) con predominancia morfológica epitelioide y con ausencia de un tumor primario conocido.

De los resultados obtenidos en el presente trabajo mediante la aplicación del anticuerpo c-kit (CD117) a nuestra casuística, podemos afirmar en primer término que el aspecto controversial que presentan estos tumores respecto de la aseveración de malignidad que se discute en la literatura, está también presente. Igualmente se considera de alguna utilidad predictiva el tamaño tumoral (más de 6 cms.) y el índice mitótico con más de 2 mitosis por 50 HPF o CAA (HPF o CAA: Campos de Aumento Mayor; 1 = 0,159 mm2)(16), aún cuando existen otras proposiciones. El pleomorfismo es paradojal, lo que se aprecia por las variantes epitelioides, y las mitosis atípicas e invasión vascular son raras de encontrar. Las lesiones epitelioides serían de mayor riesgo que las fusocelulares y más probablemente benignas las que muestran marcadores mioides. La aneuploidía también se considera correlacionada con peor pronóstico (Tabla 4). En consecuencia, ante la presencia de pacientes portadores de un GIST se enfatiza la cautela diagnóstica del patólogo y el seguimiento a largo plazo de estos, dado que necesitan ser evaluados constantemente y por tiempo indefinido, existiendo la confianza que con los avances de la biología molecular se obtenga una mejor apreciación pronóstica(31,34,57).

TABLA 4
FACTORES PRONÓSTICOS Y RIESGO DE MALIGNIDAD
	BAJO	ALTO
TAMAÑO TUMORAL	< 5 CM	> 5 CM
CELULARIDAD	BAJA	ALTA
NECROSIS	AUSENTE O MINIMA	PUEDE SER PROMINENTE
MITOSIS	< 5 POR 50 CAA	> 5 POR 50 CAA
PATRON DE CRECIMIENTO	SIN INFILTRACION	PUEDE INVADIR ESTRUCTURAS ADYACENTES
MUTACION DE c-KIT	AUSENTE	FRECUENTEMENTE PRESENTE
* CAA: Campos de Aumento Mayor; 1 = 0,159 mm2

En consecuencia, podemos postular que la utilización del anticuerpo c-kit (CD117) en los laboratorios de histopatología, es útil y recomendable para definir un diagnóstico diferencial cuando la biopsia proviene de tumores estromales gastrointestinales e incluso, existen estudios que indican una quimioterapia específica con Imatinib, que es un inhibidor potente y específico no sólo de la molécula normal de KIT, sino que igualmente de las que portan las mutaciones presentes en los GIST, basándose en procedimientos IHQ de rutina para la identificación del c-kit.(61-65)


CONCLUSIONES

Los GIST son tumores mesenquimatosos c-Kit (+) del tracto gastrointestinal. Es muy probable que los GIST incluyan a los GANT (tumores de nervios autonómicos gastrointestinales), mientras que los tumores verdaderos de músculo liso y de las células de Schwann del tracto gastrointestinal no tengan mutaciones para la proteína KIT y por lo tanto, no la sobreexpresen.

Existen evidencias de que la expresión de KIT y las mutaciones que resultan de su activación como mecanismo oncogénico crucial en la mayor parte de los GIST, se deban a que las células intersticiales de Cajal (CIC) requieren para su desarrollo de la actividad funcional normal de ésta proteína. Refuerza lo anterior el hecho de que en los síndromes de GIST, los familiares poseen mutaciones de ganancia de función de KIT en la línea germinal e hiperplasia de las células intersticiales de Cajal,(63,66) lo cual sirve como un marcador fenotípico nuevo y confiable para los GIST, siendo la inmunorreactividad decisiva frente a un grupo de tumores derivados de estas CIC o que muestran diferenciación hacia este tipo celular, en tanto que las neoplasias del estroma de células fusiformes o de tipo epitelioides (-) para c-Kit son muy raras excepciones a esta regla.

Las mutaciones señaladas anteceden a las aberraciones citogenéticas y por lo tanto, acontecen muy precozmente en el desarrollo del 90-95% de los GIST determinando la proliferación de los tumores avanzados. Investigaciones recientes han determinado que el estado de la mutación de KIT es el predictor más importante en la respuesta del paciente tratado con Imatinib (inhibidor específico de la tirosina kinasa),con un 80% de éxito en tumores con una mutación del exón 11 y sólo de 9% en tumores con mutación no identificable, con lo cual la terapia de los GIST presenta un nuevo enfoque de tratamiento, especialmente cuando los tumores estromales gastrointestinales son c-Kit (CD117)(+) de tipo maligno y/o inoperables.

En consecuencia, es altamente recomendable el uso de c-Kit (CD117) con el objetivo de confirmar el diagnóstico de GIST, como lo es el que cada nuevo lote de anticuerpos y sus diluciones, sea estandarizado usando controles positivos y negativos apropiados para lo cual es necesario que en el acto operatorio de resección del tumor se incluya también parte de la mucosa intestinal normal (epitelio) para poder utilizar a los mastocitos –que son células positivas para c-Kit- como control positivo interno de la inmunorreacción.

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