Cuba

Objetivos: Introducir una técnica para el diagnóstico rápido del Megacolon Agangliónico y evidenciar de forma específica la presencia de células ganglionares en las biopsias de colon y recto.

Material y Método: A partir del año 1997 en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Pediátrico “Juan Manuel Márquez” comenzamos a utilizar la técnica histoquímica NADH-Tetrazolium reductasa para demostrar la presencia de células ganglionares en las biopsias de recto de pacientes procedentes del Servicio de Cirugía. Las muestras de tejido llegan al departamento en fresco para ser estudiadas por congelación, se orientan adecuadamente los extremos distal y proximal y se realizan múltiples cortes seriados en un criostato. Posteriormente se tiñen algunos cortes con Hematoxilina y Eosina, el resto de los cortes son utilizados para realizar la técnica enzimática NADH-Tetrazolium reductasa, después de terminar la técnica, las láminas son entregadas al especialista para observarlas al microscopio óptico y poder emitir si se observan o no las células ganglionares. Digitalizamos algunas imágenes para mostrar mejor nuestros resultados.

Resultados: Con la técnica de Hematoxilina y Eosina se observan células de aspecto ganglionar con citoplasma rosado abundante, núcleo en azul excéntrico con nucleolo prominente y prolongaciones citoplasmáticas. La técnica NADH-Tetrazolium reductasa demuestra la actividad oxidativa mitocondrial de las células ganglionares y cuando estas células están presentes se observan de color azul.

Conclusiones: La técnica NADH-Tetrazolium reductasa se introdujo en nuestro laboratorio de manera satisfactoria pues permite observar la presencia o no de células ganglionares de manera rápida y específica en las biopsias por congelación procedentes de pacientes con diagnóstico clínico de Megacolon Agangliónico.

Harold Hirschsprung describió en 1888 una enfermedad congénita en la que se presentaba estreñimiento, distensión abdominal, desnutrición y en esa época, mortal en todos los casos. Tenía como característica una gran dilatación del colon y desde entonces se le conoce como megacolon congénito o Enfermedad de Hirschsprung. (1)
Esta enfermedad se caracteriza por la ausencia de neuronas (células ganglionares) en el intestino grueso. La inervación anormal se prolonga en sentido proximal y de forma contínua desde el ano hasta una distancia variable, lo que conlleva una obstrucción funcional con dilatación del segmento del colon proximal al afectado. (2,3,4,5)
El megacolon agangliónico congénito es la causa más frecuente de obstrucción intestinal baja en el neonato, con una incidencia global de 1:5000 a 8000 recien nacidos vivos, siendo mayor su frecuencia en los hermanos de los pacientes (3,6 %). Predomina en el sexo masculino, con una relación 4:1 con respecto al sexo femenino. (2,3)
El aganglionismo de segmento corto con megacolon es más frecuente en los niños, mientras que en las hembras lo es la afectación de segmentos largos. (2)El 10 % de los casos afecta a niños con Síndrome de Down y en otro 5 % se encuentran alteraciones neurológicas importantes, lo que hace pensar que esta enfermedad es solo una de las manifestaciones de un desarrollo anormal más generalizado de la cresta neural. (2,3)
La biopsia por congelación es un método práctico para documentar la ausencia de células ganglionares y debe utilizarse para determinar el nivel de resección del intestino durante la operación. (4,5)
Dada la importancia que tiene emitir un diagnóstico rápido y seguro durante una biopsia por congelación, nos motivamos a realizar este trabajo, donde introducimos en nuestro Hospital una nueva técnica de procesamiento rápido y útil para un diagnóstico eficaz durante el transoperatorio.

A partir del año 1997, en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Pediátrico “Juan Manuel Márquez”, se comenzó la aplicación de la técnica Histoquímica NADH-Tetrazolium reductasa para observar las células ganglionares.
Las muestras de tejido llegan al Departamento en fresco para ser estudiadas por congelación, se orientan adecuadamente los extremos distal y proximal, realizando posteriormente múltiples cortes seriados en un criostato.
En la Técnica de Hematoxilina y Eosina las secciones de tejido se introducen en la Hematoxilina Harris durante 2 minutos aproximadamente, luego se lava en agua corriente y se diferencian los núcleos en el alcohol ácido al 1 %. Se pasa al agua corriente para dejar azulear los núcleos. Posteriormente se introduce en Eosina y se deshidrata en alcoholes ascendentes, pasa al xilol y se monta con Bálsamo de Canadá.
Los cortes obtenidos para realizar la Técnica del NADH se fijan en acetona fría y se procede de la siguiente manera:

Soluciones de Trabajo:
- Nitroblue tetrazolium
- NADH
- Buffer fosfato 0.2 M a pH= 7.4

Para preparar el medio de incubación se disuelve en el agua destilada el Nitroblue Tetrazolium y el NADH, se agrega el buffer fosfato y se filtra antes de usar.

Procedimiento:
- Aplicar sobre los cortes el medio de incubación durante 3-5 mtos. a 37 grados C.
- Lavar en agua destilada y chequear al microscopio.
- Deshidratar en etanol a concentraciones ascendentes.
- Aclarar en Xilol.
- Montar con bálsamo de Canadá.

Después de terminada la técnica, las láminas son entregadas al Patólogo para su observación en el Microscopio óptico y de esta forma poder emitir si se observan o no las células ganglionares.

Con la Técnica de rutina Hematoxilina y Eosina se observan células de aspecto ganglionar con citoplasma abundante eosinofílico, núcleo excéntrico con nucleolo prominente y prolongaciones citoplasmáticas. Fig_1 Fig_2

La Técnica NADH-Tetrazolium reductasa demuestra la actividad oxidativa mitocondrial de las células ganglionares, cuando en el fragmento de tejido están presentes las células, éstas se observan de color azul. Fig_3 Fig_4

El diagnóstico de Megacolon Agangliónico está basado en la demostración de células ganglionares en los plexos intestinales.
El proceso final de la biopsia se hace por el método histológico de parafina, el cual es sencillo, pero requiere de varios días para llegar al diagnóstico, por esta razón el proceso por congelación es el que se utiliza para emitir un diagnóstico durante el transoperatorio.
En la mayoría de los Hospitales se tiñen los cortes por congelación con la técnica de Hematoxilina y Eosina y en otros utilizan además la técnica Azul de Toloidina, con las cuales a veces se enlentece un poco la observación de las células ganglionares porque se tiñen en igual tono todas las células de la preparación, lo que conlleva a una búsqueda más cuidadosa con el microscopio óptico. Con la técnica de NADH Tetrazolium-reductasa se observan únicamente las células ganglionares, lo que hace menos estresante para pacientes, patólogos y cirujanos.
Durante la exploración que realizamos en otros departamentos de Anatomía Patológica del país, constatamos que dicha técnica no es utilizada para el diagnóstico de esta enfermedad; revisando la literatura encontramos que nuestros resultados coinciden con los trabajos revisados de Dudorkinova D. y colaboradores quienes también plantean la ventaja de la técnica por contar con un medio de incubación rápido, lo cual es factible para dar un diagnóstico en el menor tiempo posible. (6,7)
Además nos parece interesante destacar que en el medio de incubación, la sal de tetrazolium que utilizamos es la Nitro BT Tetrazolium ya que según la literatura es la que proporciona mejores resultados permitiendo la deshidratación de los cortes en alcohol y el montaje después del aclaramiento en xilol, con el fin de poder guardar las preparaciones por más tiempo. (8)

1. Mondragón L, y Torres T. Enfermedad de Hirschsprung. Estudio de 50 casos. Problemas de diagnóstico y tratamiento en México. Acta Pediátrica de México, No.6. Volumen 20
2. Ramzi S. Cotran, Vinay Kumar y Tucker Collins. Patología Estructural y Funcional de Robbins. Sexta Edición. España. 1999. Págs. 836-840.
3. Behrman RE, Kliegman RM y Arvin AM. Tratado de Pediatría de Nelson. Vol. II. 15ª Edición. Editorial Ciencias Médicas. Ciudad de la Habana. 1998. Pág. 1346-1348.
4. Anderson JR. Compendio de Anatomía Patológica y Patología General. Tomo II. 2da Edición. Editorial Científico Técnica. Ciudad de la Habana. Cuba. 1982. Pág. 746.
5. Rosai J. Ackerman. Patología quirúrgica. Tomo I. Edición Revolucionaria. Editorial Científico-Técnica. Ciudad de la Habana. Cuba. 1985. Págs. 468, 516-518.
6. Dudorkinova D, Skaba R, Lojda Z, Dubovska M. Application of NADH tetrazolium reductase reaction in perioperative biopsy of dysganglionic large bowel. Eur J Pediatr Surg 1994 Dec; 4(6): 362-5
7. Dudorkinova D, Skaba R, Lojda Z. Personal experience with the use of peroperative biopsy in surgery for intestinal aganglionosis. Cesk Pediatr 1992 Jun; 47(6): 326-9
8. Barka T y Anderson P.J. Histoquímica. Editora ATIKA. S.A. Madrid 1967. Pág. 359-363.

El 5/3/2004 19:22, Sara Mandado Pérez dijo:

El 10/3/2004 17:15, Irina Hernández Melendi dijo:

El 11/3/2004 15:39, Irina Hernández Melendi dijo: