MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS DEL DESARROLLO EMBRIOLÓGICO EN EL MÚSCULO ESTRIADO DE LAS EXTREMIDADES FETALES.

Teresa García Miralles (*)

Javier Gosalbez García (**)

(*) Servicio de Anatomía Patológica II. Hospital Central de Asturias

(**) Servicio de Traumatología I. Hospital Central de Asturias

El motivo de nuestro trabajo ha sido:

Estudiar el patrón histológico del desarrollo del mesenquima de la extremidad fetal mediante técnicas de microscopía óptica y tinciones de Hematoxilina-Eosina.

Analizar los diferentes estadios de diferenciación celular del músculo fetal en relación con el tamaño de la extremidad y la edad fetal.

Utilizar las técnicas de inmunohistoquímica y anticuerpos monoclonales para determinar la secuencia de adquisición de marcadores específicos de tejidos muscular fetal.

Analizar los resultados obtenidos con los distintos marcadores; desmina, actina y miosina para músculo liso y estriado.

Comparar cuantitativa y cualitativa la presencia de los marcadores específicos musculares a lo largo del desarrollo de la extremidad fetal.

DIFERENCIACION.

La primera consideración sobre el desarrollo de los embriones humanos comienza con la regulación por cambios moleculares y reorganización celular que ocurren antes de la fertilización. Cambios producidos en el patrón de la síntesis de macromoléculas y la modificación y organización de la estructura del citoplasma y membrana, ocurren durante la fase terminal de la oogénesis, es decir el periodo de la meiosis que precede a la ovulación. Estos cambios representan la expresión de un programa sobre el desarrollo que prepara al oocito para la fertilización y posterior desarrollo. Existen en la actualidad grupos de investigación que tratan de averiguar como esta programación a nivel molecular y celular que posee el oocito son regulados y coordinados en el estadio preovulatorio de la oogénesis

Una vez que el ooocito es fertilizado él porque las células embrionarias forman diferentes tejidos y estos poseen una disposición ordenada en el espacio que de lugar a órganos, es otra de las propiedades más incomprendida de los organismos en desarrollo.

Él por qué es capaz el embrión de producir los diferentes tipos celulares del cuerpo que generen condrocitos, miocitos, adipocitos…, y además estas células posean la capacidad de sentir sus posiciones relativas en el interior de una población limitada de células y el que puedan ser organizadas en diferentes órganos y estructuras funcionales que además de poder sintetizar hueso, cartílago, vasos etc. se convertirán en humero, aorta, tríceps.. Etc. es uno de los principales debates y experimentación de los últimos años.

Los mecanismos de la diferenciación y él porque a partir de unas células madres (stem cells) se puede llegar a formar diferentes tejidos u órganos, el que existan células en el ser humano que mantienen la potencialidad de continuar reproduciéndose como ocurre con las células hematopoyeticas y hepáticas y a la vez hay otras células que incluso en el momento del nacimiento pierden la posibilidad de multiplicarse como ocurriría con las cardiacas, continua siendo objeto de estudio y debate.

La llamada desdiferenciación es otro fenómeno de interés. Tejidos adultos puede metaplasiarse es decir convertirse en otro tejido, por lo que se puede suponer que ante determinadas circunstancias, células diferenciadas conservan algo de potencialidad de las células multipotenciales y pueden transformarse en otro tejido como ocurre con los llamados ratones articulares (cuerpos cartilaginosos) en que la sinovia se convierte en tejido cartilaginoso.

También los cambios reparativos como seria el tejido de gratulación, las cicatrices o los cambios isquemicos musculares remedan ciertas etapas del desarrollo embrionario del mesenquima.

Por lo tanto los fenómenos de diferenciación, desdiferenciación y reparación son campos importantes de estudio.

La relación de la transformación maligna (carcinomas o sarcomas) de diferentes tejidos con los procesos de diferenciación y desdifernciación y el paralelismo existente entre algunos tipos de tumores malignos desde el punto de vista morfológico y etapas determinadas del desarrollo embrionario son así mismo fenómenos importantes.

El desarrollo humano a partir de células madre embrionarias que dan lugar a la generación de estructuras totalmente nuevas es contrario a lo que ocurre en los tejidos adultos que con escasas excepciones no son capaces de regenerarse.

En los humanos existen dos tipos de células madre: las células madres embrionarias y las células madres adultas.

Mientras que las células madres embrionarias son capaces de formar diferentes tejidos, las células madres adultas solo controlan la producción de un determinado tejido como ocurre con las células básales de la piel que solo son capaces de formar tejido cutáneo.

¿Cuál es la diferencia entre las células madres embrionarias o adultas y cuales son los factores que regular el diferente modo de comportarse unas u otras?. Aunque existen mucho desconocimiento sobre estas diferencias, una cosa es clara, las células madre embrionarias pueden dar lugar a un organismo entero porque colonizan la línea germinal. Las adultas pueden dar lugar a la línea sanguínea, piel, hígado pero nunca a la línea germinal, esta diferencia es fundamental.

La interrelación entre la información que posee una célula madre germinal y la influencia del entorno en que se sitúa también es un factor determinante en el posterior desarrollo de los diferentes tejidos y órganos.

DESARROLLO HISTOLOGICO DEL MÚSCULO DEL MESENQUIMA EMBRIONARIO

En el desarrollo del embrión humano existen muchos textos y conocimientos sobre aspectos puramente anatómicos desde el estadio de mórula, gástrula, embrión y feto al nacimiento. No obstante existe poco publicado sobre los cambios histológicos que sufren los tejidos y órganos a través de la vida embrionaria y puesto que el mesenquima embrionario es uno de los sistemas que dará lugar a un mayor numero de diferentes tejidos adultos (cartílago, hueso, sinovia, tendones, fascias, músculo, vasos, tejido adiposo….) el estudió de su desarrollo puede servir para en cierto modo entender el fenómeno de la diferenciación.

Hertwing en 1941 introduce el termino de "mesenquima" señalando que en un principio todas las células de cada una de las capas embrionarias son iguales y que más tarde cada grupo de células se organiza en tejidos específicos dando lugar a diferentes órganos y sistemas (2). El término de mesenquima engloba a todo el mesodermo no epitelial indiferenciado de los embriones y fetos. Del mesodermo deriva:

A.- El epitelio de las gónadas y sus ductos, los riñones y sus ductos y la parte cortical de la suprarrenal

B.- El mesotelio que tapiza las cavidades celomicas (pleura y peritoneo)

C.- El mesenquima (Gr.mesos= medio, enchyma= that wich is poured in) o el precursor del tejido conectivo, vascular, esquelético, muscular y hematopoyetico

Un modo de estudiar el mesenquima embrionario y sus cambios es estudiando las diferentes etapas desde el punto de vista histológico que sufren los tejidos de las extremidades en embriones y fetos humanos.

La yema de las futuras extremidades aparece entre la 3ª y 4ª semana como una proyección de la parte dorsal de la somatopleura, algo ventral a los somitos, el de las extremidades superiores y un poco mas abajo el de las inferiores (3).

Cada yema consiste en un mesenquima indiferenciado cubierto de ectodermo (fig.1ª,1b,1c,1d)

La diferenciación de este mesenquima comienza en la parte proximal y se extiende distalmente a medida que el miembro sé elonga.

Durante muchos años se pensó que toda la musculatura esquelética del cuerpo , excepto la de los arcos branquiales, procedía de los miotómos paravertebrales y que los músculos del cuerpo se formaban por migración de células procedentes de dichos miotomos.

Posteriormente se comprobó que el músculo del cuerpo y también el de las extremidades procedía del mesemquima local y no de la migración de las células miotomales paraaxiales.(3 )

Las yemas del embrión, que luego darán lugar a los miembros, están formadas en un principio por células de núcleos redondos u ovales, con escaso citoplasma presentando marcado monomorfismo celular (fig 1a)

Las células musculares más inmaduras son los mioblastos,células pequeñas, redondas ó fusiformes (fig 4), mononucleadas con un nucleolo prominente e intensa actividad mitótica. Los mioblastos no contienen filamentos detectables microscópicamente, pero en estos se pueden detectar ribosomas.

Los mioblastos bien por fusión, bien por mitosis formarán los miotúbulos , el siguiente paso dentro de la miogénesis (4,5). Entre cada grupo de células se pueden observar agregados de células intersticiales.(6)

Los miotúbulos difieren de los mioblastos por ser multinucleares

(fig 5,6) y por la presencia de filamentos citoplasmáticos. La síntesis de las proteínas contráctiles se inicia en este estadio (6-7) las cuales se depositan inicialmente en el eje central del miotúbulo (fig 7, 8); el núcleo se va desplazando periféricamente a medida que se va formando mas proteína contráctil (fig 9)

En resumen los estadios de diferenciación son:

1.Trasformación de células mesenquimales indiferenciadas redondas en mioblastos mononucleareas alargadas con núcleo granular.

2. Fusión de los mioblastos en miocitos sincitiales o miotúbulos formando células multinucleadas .

3. Síntesis de miofilamentos los cuales se integran en miofibrillas.

4. Crecimiento de los miotúbulos, formación de miofilamentos adicionales

y formación de los llamados "Hallow tubes".

5. Organización funcional de los miofilamentos en miofibrillas y en sarcomerás con actividad contráctil y desarrollo de la sinapsis neuromuscular.

Gilmour estudio embriones en estadio pre-somitico y concluyo que los vasos derivaban de las células mesenquimales indiferenciadas, que en un principio, los capilares no se comunican entre sí y que más tarde se producían las anastomosis por lo que la sangre ya podría circular (9).

Los vasos sanguíneos, incluso los más grandes) como la aorta, proceden de una red capilar que crece a la vez las yemas de las futuras extremidades (9). Alrededor de la 4ª semana los embriones humanos poseen un sistema vascular bien formado. Tanto las arterias como las venas se diferencian a partir de los plexos capilares. El desarrollo y diferenciación de los vasos depende de factores mecánicos a que este sometido el tejido donde asientan

MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS DEL TEJIDO MUSCULAR

Se han utilizado diferentes métodos inmunohistoquimicos para detectar la presencia de filamentos específicos musculares (16-17,18). Los marcadores más utilizados para el músculo liso y estriado son:

GLOBINAS:

Tanto la hemoglobina como la mioglobina son globinas, proteínas transportadoras de O2 que constan de varias cadenas polipeptídicas y una porción hemo a la que se une el hierro.

Mioglobina.

La mioglobina facilita el transporte de O2 en el músculo y sirve como reserva de O2 en este tejido Es una proteina bastante pequeña (17,8 kdal), consta casi exclusivamente de residuos no polares en su interior mientras en su exterior contiene polares y no polares. Alrededor del 40% de la cadena polipeptica es helice alfa Fácil de preparar en cantidad y que cristaliza fácilmente. Los músculos esqueléticos de los mamíferos son ricos en mioglobina que sirve como almacén de oxigeno. Esta formada por un grupo "hemo" que es una porfirina sustituida con un átomo central de hierrodonde se localiza el centro de enlace del O2 y cadenas alfa polipeptidicas.

Fue uno de los primeros anticuerpos marcadores de músculo esquelético y marca tanto el músculo esquelético como los sarcomas deribados de este es decir los rabdomiosarcoma (-18-19-20, 21). En la actualidad es poco utilizado debido a que su comercialización es en forma de anticuerpo policlonal y por lo tanto su especificidad es menor que la de otros marcadores musculares .

FILAMENTOS CITOPLASMÁTICOS:

Existen tres tipos de filamentos en el citoexqueletico, los microfilamentos (6nm), los intermedios (10nm) y los filamentos gruesos (25nm)

Los filamentos intermedios, junto con los microfilamentos y microtubulos, forman una extensa red citolplasmatica celular llamada citoesqueleto. El termino intermedio se refiere al diámetro del filamento (10 nm). Estan compuestos por una familia de al menos 5 clases de proteinas (los microfilamentos por una sola proteina) que definen inmunohistoquimicamente a los filamentos intermedios, cada una de las cuales presenta una especificidad tisular distinta.

Los filamentos intermedios incluyen : las citoqueratinas (marcadoras de células epiteliales), vimentina (marcadora de células mesenquimales), la proteina glial acidica (marcadora de glia), los neurofilamentos (marcadora de neuronas) y la desmina (marcadora de músculo).

Desmina:

La desmina también conocida como esqueletina, es un filamento intermedio que se encuentra en las celulas del músculo liso, esqueletico y cardiaco. En las miofibrillas, la desmina se localiza en las bandas Z del músculo esquelético y cardiaco, en regiones de uniones intercelulares, en los sitios de oposición de la banda Z con la membrana plasmática y en los discos cardiacos intercalados

(22,23,24).La especificidad de la desmina en las células musculares la convierte en un marcador útil para identificar sarcomas que procedan de células musculares lisas (leiomiosarcoma) y estriadas (rabdomiosarcoma).

FILAMENTOS GRUESOS Y DELGADOS:

El músculo estriado de los vertebrados consta de dos clases de filamentos proteicos que interreaccionan entre si. Los filamentos gruesos contienen miosina, mientras que los filamentos delgados contienen actina. La hidrólisis de ATP unido a la miosina dirige el deslizamiento de estos filamentos uno sobre otros Los filamentos grueso (24 nm) y los delgados (6nm) forman parte del citoesqueleto y tanto la actina como la miosina intervieren en la contracción muscular.

.Actina especifica del músculo liso

Se encuentra en las fibras del músculo liso. Estas células se pueden identificar en la pared de los vasos, muscular y mucosa y muscular propia de pared intestinal y en células estromales de diferentes tejidos.

También reacciona con las células mioepiteliales de diferentes glándulas, sobre todo con las salivares y mama. En tejidos neoplásicos es útil en la identificación de leiomiomas y leiomiosarcomas. También marca tumores blandos miogenicos

Es decir sin diferenciación hacia músculo liso o esquelético y diferenciación del músculo liso (25,26,27).

.Miosina

Forma parte de los filamentos gruesos, es una molécula muy grande (540 kd), contiene dos cadenas pesadas idénticas y cuatro cadenas ligeras. La fuerza de la contracción muscular se produce por la interacción de la miosina, actina y ATP.

El anticuerpo antimiosina humana reacciona con las cadenas gruesas de la miosina esquelética. No reacciona con el músculo cardiaco ni la miosina del músculo liso. Identifica tumores de origen muscular y también puede ser utilizado para el estudio de la arquitectura citoesqueletica de los filamentos gruesos (28,29).

MATERIAL Y METODOS

El material de este trabajo, procede los archivos de bloques y laminillas del Servicio de Anatomía Patológica II del Hospital Central de Asturias.

EMBRIONES Y FETOS.

Se estudiaron un total de 17 embriones y fetos, siendo seleccionados para el estudio un numero representativo de los diferentes estadios del desarrollo del músculo esquelético.

Los fetos menores de 3 cms. (4), se incluyeron en su totalidad y de los fetos mayores de este tamaño (13) se tomaron secciones transversales y longitudinales de la extremidad superior e inferior.

La conservación de los tejidos no era la optima puesto que es un estudio retrospectivo y muchos de los embriones procedían de circunstancias patológicas del embarazo.

El tiempo transcurrido desde la obtención del material hasta su inclusión en formol para la fijación fue de 1 a 5 hrs.

A su llegada al Servicio de AP, todos los fetos se median longitudinalmente (craneo-talón) y se reseñaba en la descripción macroscópica su tamaño en cms.

Después de la fijación (de +- 24 hrs) el tejido se incluía para ser procesado en autoprocesadores para su deshidratación , inclusión en parafina y aclaramiento de los tejidos.

Se realizaron sobre el tejido fetal secciones de 4 micras y tinciones de Hematoxilina Eosina, Tricrómico de Mason y PAS.

Para los estudios inmunohistoquímicos se seleccionaron 7 fetos que representaban por su tamaño estadios de desarrollo embrionario del músculo esquelético.

De cada uno de los bloques de los diferentes fetos se efectuaron 10 cortes sobre portaobjetos tratados con Histogrip (ZIMED) secándose en estufa de 60 grados.

Los estudios inmunohistoquimicos se realizaron con el método del Sistema de En Vision plus en que se siguen una serie de pasos:

ANTICUERPOS UTILIZADOS:

Se emplearon anticuerpos primarios frente a:

Tabla 1

La positividad para los diferentes anticuerpos fue valorada como una reacción positiva, Si el tejido adquiría un tono amarillo-marrón cuya intensidad era marcada e igual al control se consideraba como con (+++). Cuando el tono de la tinción era menos intenso (marrón claro) se consideró como (++) o (+) y si no existía presencia de tonalidad marrón, se considero negativa (-).

Así mismo se valoró la disposición de la positividad en el premúsculo y músculo.

RESULTADOS

La exposición de los resultados las presentamos en forma de Tablas en las que primero expondremos los diferentes cambios del desarrollo del músculo fetal desde los embriones de menor tamaño (incluidos en totalidad), hasta el del músculo de las extremidades de los fetos de 28 cms. La observación de estos cambios se hizo preferentemente con la tincion de Hematoxilina Eosina aunque ocasionalmente observasemos la tincion de tricromico y de PAS.

RESULTADOS EXAMEN HEMATOXILINA – EOSINA:

La edad de los embriones y fetos se refiere a la edad intrauterina que bien se conocía por la información clínica o se dedujo por el tamaño del feto.

Tabla 2 (figs. 2 - 3 – 4 – 5 -6 )

Tabla 3 (Figs 7-8-9-10)

Feto Nº	cms	Edad	Patrón muscular
Nº 5	4	10 sem.	Miotubulos con núcleos centrales Algún miotubulo con sarcoplasma relleno
Nº 6	6.5	12 sem	Miotubulos con sarcolema relleno Miofibrillas, estriaciones transversales
Nº 7	7.5	13 sem.	Miotubulos rellenos de miofilamentos Agrupación en haces musculares

Tabla 4 (Figs 10 – 11 - 12 )

Tabla 5 (fig 11 – 12 - 13)

RESULTADOS INMUNOHISTOQUIMIA:

Como indicamos anteriormente, además de estudiar el patrón histológico del desarrollo del músculo en las extremidades de los fetos con las tinciones habituales de hematoxilina-eosina y tricromico analizamos la presencia de marcadores musculares por técnicas de inmunohistoquimia con anticuerpos primarios contra la desmina, alfa-actina especifica de músculo liso y miosina humana.

La positividad la marca el hallazgo intracelular de una tinción con coloración que varía del amarillo tenue al marrón y cuya intensidad viene indicada mediante cruces, siendo una cruz débilmente positiva y tres cruces fuertemente positiva y equivalente a los controles utilizados. También se exponen en las tablas si la tincion es difusa o localizada en el tejido y si posee diferentes grados de intensidad en las fibras.

Exponemos en forma de tablas los resultados así como la localización de la positividad en los 7 fetos estudiados que como señalamos anteriormente fueron seleccionados del total de los casos por representar diferentes estadios de evolución del músculo y por la mejor conservación del tejido.

FETO Nº 1,

TAMAÑO = 1.5 CMS EDAD = 5-7 SEMANAS (intrauterina)

PATRÓN HISTOLÓGICO= Células redondas indiferenciadas, algunas fusiformes con núcleos centrales, citoplasmas ó escasos ó inaparentes, Presencia de algún vaso con hematíes nucleados El único elemento claramente diferenciado es el cartílago. Epidermis con una sola capa.

Tabla 6 ( Fig 14 )

FETO Nº 5

TAMAÑO = 4 CMS

EDAD = 10 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO= Miotúbulos con núcleos centrales, algún miotúbulo con sarcolema relleno en la periferia, ocasional miotúbulo totalmente relleno.

Tabla 7 ( Fig 15)

.

FETO Nº 7

TAMAÑO = 7.5

EDAD = 12 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO= Presencia de algunos miotubulos con sarcolemas vacíos y miofibrillas en periferia, otros miotubulos rellenos y con estriaciones transversales, núcleos periféricos.

Tabla 8 ( fig 16)

.

FETO Nº 9

TAMAÑO = 12.5 CMS EDAD = 16 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO: Presencia de miotúbulos rellenos con núcleo excéntrico y pequeño y con algunas estriaciones en la periferia. También se mantienen algunos miotúbulos vacíos.

Tabla 8 ( fig 17 )

FETO Nº 10

TAMAÑO = 13 CMS

EDAD = 15 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO: Fibras con núcleos periféricos agrupadas en fascículos y alguna estriación en periferia.

Tabla 8

.

FETO 14

TAMAÑO = 18 CMS

EDAD = 20 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO: Fibras musculares agrupadas en haces, rellenas y con núcleos periféricos. Ocasionales estriaciones transversales situadas hacia periferia.

Tabla 8 ( fig 18 )

FETO Nº 17

TAMAÑO = 28 CMS

EDAD = 28 SEMANAS (intrauterina)

PATRON HISTOLOGICO: Fibras musculares agrupadas en haces, rellenas y con núcleos periféricos. Claras estriaciones transversales.

Tabla 9 ( figs 19 –20 )

Tabla 10 RESUMEN DE INMUNOHISTOQUIMIA

DISCUSIÓN

Estudios recientes en medios de cultivo están reproduciendo lo que en condiciones normales ocurre en los embriones y fetos. La posibilidad de que las células madres totipotenciales, las iniciales que constituyen el embrión puedan multiplicarse en medios de cultivo añadiéndole a los medios factores genéticos que comiencen a dividirlas y diferenciarlas en direcciones determinadas abre grandes posibilidades a la investigación. Estos trabajos no solo están siendo publicados en medios científicos si no que su información y discusión esta presente a nivel de medios de difusión populares (29).

Muchos investigadores piensan que el estudio de las células embrionarias es en extremo importante puesto que el obtener a partir de ellas otras células con una función especifica puede conllevar a su utilización para tratar enfermedades tales como la diabetes, el parkinson, alzheimer y otras series de daños neurológicas, vasculares y neoplásicos.

No obstante también se mantiene que no se debe dejar de estudiar las células madres adultas ni los procesos regenerativos a partir de ellas.

Posiblemente, aunque en un principio parece muy diferente el camino que siguen las células madres embrionarias con su pluripotencialidad para diferenciarse en distintos tejidos y el de las célula madre adulta que solo pueden forman un determinado tejido, existen condiciones por las que en tejidos que contiene células perfectamente diferenciado o incluso en cierto tipo de tumores procedentes de una rama celular, aparecer tejidos o células consideradas de diferente ramas embrionarias.

Este fenómeno, la llamada "metaplasia" consiste en se forman tejidos diferentes a aquellos en donde se produce el proceso. Así vemos por citar algún ejemplo como se puede formar hueso en procesos reparativos como cicatrices o hemorragias, en las válvulas cardiacas con procesos degenerativos, en el músculo estriado como ocurre con la miositis osificante, o en la pared de las arterias con arteriosclerosis. También existe hueso y cartílago metaplasico en tumores mamarios, tumores mixtos genitales, tumores de la vejiga urinaria etc. La presencia de tejido metaplasico adiposo, hematopoyetico y muscular tampoco es infrecuente (3).

Hasta finales del siglo pasado, muchos biólogos aseguraban que el tejido adulto es especifico e inmutable. Desde 1893 en que Weismann consideraba que "existe una ley por la cual, cambios reparativos en cada tejido especifico solo pueden reproducir sus propias células especificas", lo contrario se ha demostrado con la metaplasia en que se puede ver la adaptabilidad que presentan las células por lo que son capaces de dar lugar a tejidos heterotopicos con potencialidad versátil para una diferenciación aberrante que no se presenta en condiciones normales. Todo esto, nos hace pensar que es posible que existan células indiferenciadas con toda su capacidad genética y pluripotencialidad entre las células adultas diferenciadas o bien que las células adultas posean ante determinadas circunstancias la capacidad de la desdiferenciacion como señala Wills y como ocurre en tejido reparativo con fibroblastos de aspecto embrionario en que el tejido regenerado adquiere un rejuvenecimiento, lo cual solo puede indicar que algunas de la potencialidad temprana de las células son conservadas o readquiridas.

Lo que ocurre de forma espontánea en el tejido humano esta tratando de ser reproducido en los laboratorios (cultivos de tejidos y células) abriéndose importantes campos de investigación con posibles aplicaciones terapéuticas futuras.

Nuestro trabajo esta centrado en el desarrollo embrionario de los diferentes tejidos mesenquimales presentes en las extremidades, lo cual puede servir como modelo para mejor comprender el fenómeno de la diferenciación celular.

Las extremidades se forman como consecuencia de un crecimiento de células mesodermales situadas en la capa mesodermal del embrión situada a un nivel axial especifico en cada mamífero.

Diferentes factores genéticos (presencia de genes específicos), ambientales ,factores de crecimiento (polipeptidos solubles y difusiones producidos en cantidades limitadas que regulan el desarrollo, proliferación, diferenciación y crecimiento celular) como la proteína de morfogenesis ósea (BMP), el factor de crecimiento fibroblastico (FGF) , o el Epidermal Growh Factor ( EGF) entre otros, promueven la formación de los diferentes tejidos de los miembros (cartílago, hueso, tendones, músculo, vasos ,nervios, grasa…) La suma de estos factores coordina la morfogénesis de las extremidades (30)

La mayoría de los estudios existente están centrados en la morfogénesis de especies no humanas como los pollos o ratones (29), existiendo pocos estudios sobre embriones humanos. El examen microscópico utilizando embriones y fetos humanos procedentes de abortos espontáneos en diferentes periodos de gestación puede ser un buen modelo para entender los diferentes pasos del desarrollo y diferenciación de las células mesenquimales desdiferenciadas así como su transformación en tejidos adultos.

Con técnicas de inmunohistoquimia y utilizando anticuerpos monoclonales, podemos, además, seguir la secuencia de la expresión de marcadores específicos de los tejidos adultos mesenquimales y los tumores de ellos derivados.

El marcaje con anticuerpos monoclonales tales como la Vimentina, S-100, Sinaptofisina, Proteina de Neurofilamentos, CD31, CD34, Colágeno IV y en especial Desmina, Alfa Actina de músculo Liso y Miosina aplicada a cortes histológicos de extremidades de embriones y fetos desde estadios tempranos en que la extremidad esta representada por células indiferenciadas (embriones de 6 semanas) a la presencia de células con características especificas pero que mantienen rasgos de inmadurez (embriones y fetos de 10, 12 y 20 semanas de gestación) hasta tejidos similares a los de los adultos (fetos de 32 semanas) sirve no solo para ver la transformación morfológica a través de los diferentes periodos de diferenciación, sino para observar cuando aparece y en su caso desaparece la positividad del marcaje con S-100, naptofisina, NF, Vimentina, CD31, CD34, Desmina Actina y Miosina entre otros marcadores de procedencia mesenquimal.

Puesto que los anticuerpos monoclonales están marcando filamentos presentes en el citoplasma celular que son inapreciables con la microscopia óptica y que en la mayoría de casos son específicos de un determinado tejido, la positividad del anticuerpo nos esta indicando en que momento del desarrollo y aun antes que la morfología nos de la indicación del tejido que es, hay rasgos diferenciales inmunofenotipicos del futuro tejido adulto que este tejido inmaduro formara.

Nuestro trabajo ha sido realizar tanto desde la observación con microscopia óptica como con técnicas de inmunohistoquimia del desarrollo de los diferentes tejidos mesenquimales en evolución ( músculo, vasos, tejido adiposo, neural, cartílago, hueso, conectivo,,,). No obstante y aunque los cortes histológicos se hicieron y la inmunohistoquimia también, en este presentación nos hemos ceñido a mostrar solamente los resultados del músculo estriado y músculo liso de los vasos con los anticuerpos Desmina, Actina y Miosina dejando para ulteriores presentaciones el resto de resultados.

La actina especifica de músculo liso (clon 1A4), es la primera que da positividad en las células redondas y fusiformes indiferenciadas, así como en las células que tapizan la red vascular primaria, ambas presentes en los fetos de 7 semanas. Se mantiene esta positividad tanto en células redondas indiferenciadas que se encuentran entre los miotubulos, como en la pared de los vasos de fetos de hasta 16 semanas (Fig 14-15-16 - 17- 18). En fetos de mayor tamaño (Fig 19-20), la actina esta muy marcada en la pared de los vasos y aun continúa existiendo con positividad débil, en algunas células indiferenciadas presentes entre las fibras musculares estriadas más diferenciadas, así como células aisladas dell tejido adiposo, osteoblastos, tejido cartilaginoso y anejos cutáneos. A esto se puede aducir que en estadios anteriores a la formación de mioblastos o miocitos, las células ya poseen filamentos de actina, que la actina aunque presente esta en poca cantidad en el músculo estriado y que algunas células adiposas, óseas y perianexiales también la poseen aunque en pequeña cantidad (¿son las celulas mioepiteliales?).

Respecto a la miosina (clon My-32) utilizada y que se sabe que reacciona con las cadenas gruesas de los filamentos de miosina presentes en el músculo esquelético y cardiaco, observamos que es positiva la reacción en las células redondas y fusiformes de los 1º estadios del desarrollo de las extremidades (Fig 14), que en los miotubulos primarios solo presentan positividad tenue en la periferia de ellos (Fig 15). Esta positividad aumenta a medida que los miotubulos se van rellenando de miofibrillas (Fig 16-17-18), siendo fuertemente positiva en el músculo estriado de los fetos que ya poseen iguales características que el músculo estriado adulto y sobre todo muestran con mayor intensidad de tinción a nivel de las estriaciones (Fig 19).Posiblemente esto nos indica que desde un principio existen en las futuras células miociticas tanto filamentos de actina como de miosina, que con la diferenciación las células hacia músculo estriado adquieren mas miosina aunque no pierden del todo la actina y que cuando el feto comienza a contraerse y se observa a microscopia óptica la presencia de estriaciones transversales , es en estas áreas donde hay mayor acumulo de miosina.

Por ultimo la desmina , filamento intermedio que se conoce que esta presente en las células adultas del músculo liso, esquelético y cardiaco, hemos visto en nuestro trabajo que no es positiva en las células redondas indiferenciadas , ni en los miotubulos primarios (Fig 14-15). Solo da positividad de forma clara cuando los miotubulos se rellenan de miofibrillas (Fig 16-17), manteniendo su positividad en el músculo estriado en los pasos secuentes de su desarrollo. Puesto que en el músculo estriado la desmina se localiza en las bandas Z, tampoco es de extrañar su positividad tardía y que no este presente en los miotubulos tempranos que no poseen miofibrillas con estriaciones transversales.

No hemos visto positiva en las paredes de los vasos, lo cual no apoya que sea marcadora universal de músculo liso.

CONCLUSIONES

Como conclusiones de nuestro trabajo podemos decir:

*- El estudio mediante microscopia óptica y tinciones de Hematoxilina Eosina del desarrollo del mesenquima en las extremidades de embriones y fetos en diferentes periodos de maduración sirve para entender la pluripotencialidad de las células madres embrionarias.

* La utilización de las técnicas de inmunohistoquimia sobre el tejido embrionario en desarrollo mostró que aun sin caracteres morfológicos de músculo estriado o músculo liso, las células indiferenciadas poseen `positividad para la actina y miosina.

* La actina, es la primera que da positividad tanto en células mesenquimales indiferenciadas como en los canales vasculares que formaran tanto el futuro músculo estriado como el liso de los vasos. A medida que crece el feto aumenta la positividad de la actina en la pared vascular y disminuye en el musculo esqueletico.

* Hay células algunas células indiferenciadas actina + en intersticio de músculo esquelético, así como en tejido cartilaginoso, óseo, adiposo y perianexial.

* La miosina también esta presente en las células indiferenciadas y aunque también se visualiza en los miotubulos primarios, su positividad aumenta al aparecer nuevas miofibrillas que rellenar los miotubulos, siendo mas positiva cuando hay presencia de estriaciones transversales en el músculo esquelético.

* Respecto a la desmina, aparece mas tardiamente su positividad , solo cuando el miotubulo esta relleno y posee estriaciones ,lo cual concuenda en lo descrito de su localización en las bandas Z.

* No se observo positividad en la pared de los vasos en ningún estadio de su desarrollo lo que nos hace pensar que no puede ser considerado un marcador universal de músculo liso.

BIBLIOGRAFÍA

1.-Hertig AT, Rock J. Development of mesenquima in embryom.Contribs.Embryol. 1941.

2.-Willis RA. The borderland of embryology and pathology. 1958;1:1-17

3.-.Kardon G. Muscle and tendón morphogenesis in the avian hind limb. Develoment. 1998;125(20):4019-32.

4.-.Okazaki K, Holtzer H. Myogenesis: fusion, myosin sinthesis, and the myotic cicle. Proc Natl Acad Sci U S A 1966;56:1484-1490.

5.-.Yaffe D. Developmental changes preceding cell fusion during muscle differentiation in vitro. Exp Cell Res 1971;66:33-48.

6.-Heffner RR. Histology for Pathologists. Second edition.Stephen Sstermberg.Lippincott Raven Publishers,Philadelphia.1997.

7.- Ishikawa H, Bischoff R Holtzer H. Mitosis and intermediate-size filament in developing eskeletal muscle. J Cell Biol 1968;38:538-555

8.-Hall SM, Hislop AA, Pierce CM, Haworth SG. Prenatal origins of human intrapulmonary arteries: formation and smooth muscle maturation. Am J Respir Cell Mol Biol 2000 Aug;23 (2): 194-203.

9.-Coons A.H. The beginning of inmunofluorescence. Inmunol 1961; 87: 499-510.

10.-Coons A.H. Histochemistry labelled antibody. Intern Rev Cytol 1961: 1-22.

11.-NakaneP.K.,Pierce, G.B. Enzime-labeled antibodies: Preparation and application for the localization of antigen. J Histochem Cytochem 1966; 14: 929-931.

12.-Taylor,C.R.I Inmunoperoxidase techniques: Theorical and practical aspects. Arch Pathol Lab Med 1978; 102: 113-121.

13.-Hsu, S.M., Ree, H.J. Self sandwich method. An improved inmunoperoxidase technic for the detection of small amount of antigen. Am J Clin Pathol 1980; 74: 32-

14.-Hsu, S.M; Raine, L; Fanger, H. Use of avidin-biotin peroxidase complex (ABC) in inmunoperoxidase techniques: A comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 1981; 29: 577-580.

15.-Bosman FT ,Lindeman J. Inmunofluorescence subcelular localization of some muscle proteins. A comparison between tissue sections and isolated myofibrils.Histoch J. 1978; 57: 61-67.

16.-Fujimory T, Hirayama D, Gotoh A, Tabata T, Yukawa M, Yamamura Y, Satonaka K, Nakamura T, Teramoto T, Kitazawa S, et al. Different origin of leimyoblastoma by immunohistochemical study.Gastroenterolo Jpn 1992 Apr;27(2):187-90

17.Kimdblom L.G., Seidal T., Karlsson K. Immunohistochemical localization of myoglobin in human muscle tissue and embryonal and embrional rabdomyosarcoma.Acta Pathol et Microb Scand 1981; 89: 271-285.

18.- Mukay, K., Rosai J. Localization of myoglobin in normal and neoplastic muscle using and inmunoperoxidase method. Amer J Sur Pathol 1979; 373-376.

19.- Perkokk ,GT.Futher considerations of fetal muscle heme protein. J Lab Clin Med 1978;610-613.

20.-Yakulis, VJ., Heller , P. The detection of myoglobin by means of inmunologic technics. Amer J Clin Pathol. 1962; 253-256.

21.-Wijnaendts LC, van der Linden JC, van Unnik AJ, Delemarre JF, Voute PA,Meijer CJ. The expression pattern of contractile and intermediate filament proteins in developing skeletal muscle and rhabdomyosarcoma of childhood: diagnostic and prognostic utility. J Pathol. 1994 dec;174(4):283-92.

22.-Kim HD. Expression of intermediate filament desmin and vimentin in the human fetal heart.Anat Rec. 1996 Oct;246(2):271-8.

23.-Yang Y, Makita T. Immunocytochemical localization of desmin and vimentin in human fetal skeletal muscle cells.Anat Rec. 1996

24.-Leslie KO, Mitchell JJ, Woodcock-Mitchell JL, Low RB. Alpha smooth muscle actin expression in developing and adult human lung.Differentiation. 1990 Aug;44(2):143-9.

25.-Barghorn A, Koslowski M, Kromminga R, Hufnagl P, Tennstedt C, Vogel M. Alpha-smooth muscle actin distribution in the pulmonary vasculature comparing hypoplastic and normal fetal lungs.Pediatr Pathol Lab Med. 1998 Jan-Feb;18(1):5-22.

26.- Lee SK, Hwang JO, Chi JG, Yamada K, Mori M.Prenatal development of myoepithelial cell of human submandibular gland observed by immunohistochemistry of smooth muscle actin and rhodamine-phalloidin. Fluorescence.Pathol Res Pract. 1993 Apr;189(3):332-41.

27.-Hughes SM, Cho M, Karsch-Mizrachi I, Travis M, Silberstein L, Leinwand LA,Blau HM. Three slow myosin heavy chains sequentially expressed in developing mammalian skeletal muscle.Dev Biol. 1993 Jul;158(1):183-99.

28.Pedrosa-Domellof F, Eriksson PO, Butler-Browne GS, Thornell LE Expression of alpha-cardiac myosin heavy chain in mammalian skeletal muscle.Experientia. 1992 May 15;48(5):491-4.

29.- (Izpisua-Belmonte. Españoles en la elite de la Ciencia. El País Semanal. 2002. nº1.345.Domingo 7 de Julio. Pag 28-39.)

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