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Página Principal Comunicaciones	MORFOMETRÍA COMPUTARIZADA EN BIOPSIAS DE NERVIO SURAL Rosa María Coro Antich , Lisette Monzón Herrera , Joaquín Galarraga Inza , Héctor Gómez Suárez y María Xiomara Gil Gil Laboratorio de Anatomía Patológica Instituto de Neurología y Neurocirugía La Habana Cuba
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen Introducción: Cuando el diagnóstico anatomopatológico se completa con el estudio histomorfométrico del nervio periférico, se obtiene información cuantitativa muy valiosa. Los cortes semifinos incluidos en resina constituyen preparaciones ideales, pero en nuestro laboratorio, por falta de recursos, los nervios se procesan para microscopía óptica con inclusión en parafina y coloración de Weigert-Pal para mielina. Objetivos: Validar la morfometría de nervio sural que se realiza en nuestras condiciones de trabajo; conocer cómo se comportan las variables morfométricas en nuestra serie de controles y caracterizar histomorfométricamente la Polineuropatía Crónica Desmielinizante Inflamatoria (CIDP). Métodos: Se estudiaron 14 biopsias de nervio sural de pacientes portadores de CIDP y 14 nervios controles. Se midieron las siguientes variables: área de los fascículos nerviosos, densidad de fibras mielínicas, diámetro de las fibras, diámetro de los axones y grosor de las vainas de mielina. Se utilizó la última versión del sistema cubano Digipat para morfometría de imágenes. Resultados: Se validó como adecuada la metodología de trabajo morfométrico que se aplica en nuestro laboratorio para los nervios surales. Las variables morfométricas de nuestros controles se comportaron de manera muy similar a los valores normales reportados en la literatura. Los resultados de este trabajo han aportado información cuantitativa a la caracterización histológica de la CIDP. Conclusión: Se debe considerar el estudio histomorfométrico de las biopsias de nervio sural como una ampliación y profundización del diagnóstico anatomopatológico de nervio periférico. Temáticas: Análisis de Imagen y Neuropatología
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción La biopsia de nervio periférico es de gran valor para el diagnóstico de muchas enfermedades del sistema nervioso periférico. De los nervios periféricos humanos susceptibles de biopsiar, el nervio sural, de naturaleza fundamentalmente sensitiva, es el que más se emplea (1). Además, se ha demostrado que el nervio sural refleja en gran medida los cambios histológicos de otros nervios distales de naturaleza sensitivo-motora (2). En laboratorios muy desarrollados los nervios se procesan para Microscopía Optica de Alta Resolución (MOAR) (3,4). Además, el diagnóstico anatomopatológico se completa con un estudio histomorfométrico del nervio (5,6) . La Morfología Cuantitativa, además de que aporta objetividad al diagnóstico (7), permite identificar el patrón de pérdida de fibras (8), y facilita la correlación clínico-histológica. En nuestro laboratorio, como no hay recursos para MOAR, se lleva a cabo un procesamiento histológico más corriente: fijación en Flemming, inclusión en parafina y coloración de Weigert Pal para mielina. Ante las diferencias de procesamiento, el objetivo principal de este trabajo fue validar la morfometría de nervio sural que se realiza en nuestras condiciones de trabajo para los diagnósticos asistenciales. Para ello se compararon biopsias de nervios normales con biopsias de pacientes con Polineuropatía Crónica Desmielinizante Inflamatoria (CIDP). Otros objetivos fueron: conocer el comportamiento de las variables morfométricas en nuestros controles con respecto a valores normales de la literatura, profundizar en la caracterización histológica de la CIDP mediante el estudio histomorfométrico y probar la última versión del sistema Digipat para morfometría de imágenes.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Se trata de un estudio retrospectivo de biopsias de nervio sural del Laboratorio de Anatomía Patológica del Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana. Las muestras se seleccionaron por consulta a la Base de datos Neupat (9):14 nervios diagnosticados como normales y 14 de pacientes con CIDP. El intervalo de edades estuvo entre 15 y 60 años. No se tuvo en cuenta el sexo. El procesamiento para microscopía óptica consistió en: fijación en Flemming, inclusión en parafina y coloración de Weigert-Pal para visualizar la mielina. El procesamiento estadístico se ejecutó con el programa Statistica versión 5.0. La morfometría computarizada se llevó a cabo con la última versión (2002) del sistema cubano Digipat (10) . A continuación se describen las tareas de Morfometría con las correspondientes pruebas estadísticas: Tarea 1: Variable Área de fascículos (AF). Contorneado manual de los fascículos y cálculo automático de las áreas (Figura_1). Se empleó la prueba de t no pareada con la corrección de Welch. Tarea 2: Variable Densidad automática de fibras mielínicas (DAFM). Es la fracción de área ocupada por fibras mielínicas con respecto al área total de la imagen. Se emplearon 10 imágenes por paciente (aumento=100x). Se segmentaron las fibras mielínicas según intensidad (Figura_2). Se utilizó la prueba U de Mann Whitney. Tarea 3: Variables Diámetro de la fibra mielínica (DF), Diámetro del axón (DA), Grosor de vaina (GV=(DF-DA)/2) y Razón G(RG= DA/DF). Se utilizaron las mismas imágenes que en la Tarea 2, midiendo unas 400 fibras por biopsia. Para las variables DF, DA, GV y RG se aplicó la Prueba de Kolmogorov-Smirnov. En esas mismas imágenes también se determinó la Densidad numérica de fibras mielínicas (DNFM), que es el número de fibras mielínicas por mm2. Las comparaciones se efectuaron mediante la Prueba U de Mann-Whitney Figura 1 Imagen de la tarea 1 en Digipat. Corte transversal de nervio sural. El fascículo 1 aparece con el valor del área. Weigert-Pal x5. Figura 2 Imagen antes de la segmentación en Digipat (Tarea 2). Corte transversal de nervio sural. Weigert-Pal x100 Imagen después de la segmentación en Digipat (Tarea 2). Corte transversal de nervio sural. Weigert-Pal x100
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados La Tabla_1 resume los resultados de comparación de todas las variables morfométricas entre los dos grupos. Variable Área de fascículos (AF): No hubo diferencias entre los dos grupos (Figura_3). Variables de Densidad (Automática y Numérica) de Fibras Mielínicas (DAFM y DNFM): La densidad fue menor en CIDP (Figura_3 ). Para conocer la eficacia del método automático de determinación de la densidad de fibras mielínicas, se realizaron pruebas de correlación de Spearman de la variable DAFM con respecto a la DNFM en controles y CIDP. En ambos casos se obtuvieron coeficientes de correlación positivos y significativos. Variables de la fibra mielínica: Diámetros de las fibras mielínicas (DF): La Figura_4 muestra los histogramas de DF. Se observa la distribución bimodal típica en los controles. El mínimo entre las dos poblaciones de fibras mielínicas está en las 7 micras. En CIDP no se observa la bimodalidad. El DF es significativamente menor en CIDP. Diámetros de los axones (DA): La Figura_5 muestra los histogramas de DA. El DA es mayor en CIDP. En ambos grupos la distribución es unimodal. Grosor de la vaina de mielina (GV): La Figura_6 muestra los histogramas de GV. El GV es menor en CIDP. Razón G (RG): La Figura_7 muestra los gráficos de RG vs DF. Las nubes de puntos de fibras grandes (DF>7 micras) y pequeñas (DF<7 micras) se ven separadas. Los resultados morfométricos de la CIDP se resumen a continuación: Las áreas de los fascículos no se alteran, disminuye la densidad de fibras mielínicas, disminuyen los diámetros de las fibras mielínicas, aumentan los diámetros de los axones y disminuye el grosor de la vaina de mielina. Validación de nuestra metodología de trabajo para los diagnósticos asistenciales: Las tareas que se diseñaron para esta investigación se ajustan perfectamente al modelo de trabajo que se sigue en los estudios morfométricos para diagnósticos asistenciales de nervios periféricos. Ha sido importante tener la certeza de que el procesamiento histológico que se realiza en nuestro laboratorio ofrece resultados muy similares a los que se obtienen con los cortes semifinos que se hacen en otros laboratorios. Prueba de la última versión del sistema Digipat: Los resultados morfométricos expuestos demuestran la utilidad del sistema Digipat dentro del ámbito de lo que se empleó del software en este trabajo. Tabla_1. Comparación entre grupos. Valores promedio Variables Control CIDP Significación DF 6.90 µm 6.41 µm <0.01 DA 2.50 µm 3.02 µm <0.01 GV 2.20 µm 1.69 µm <0.01 RG 0.36 0.46 <0.01 DNFM 7292 fibras/mm² 3426 fibras/mm² <0.01 DAFM 52.60 % 23.89% <0.01 AF 118591 µ² C129389 µ² No Figura 3 Corte transversal de nervio sural. Weigert-Pal x20. (Control) Corte transversal de nervio sural. Weigert-Pal x20. (CIDP) Zoom Figura 4 Histograma de diámetros de la fibra mielínica. (Control) Zoom Histograma de diámetros de la fibra mielínica. (CIDP) Zoom Figura 5 Histograma de diámetros del axón. (Control) Zoom Histograma de diámetros del axón. (CIDP) Zoom Figura 6 Histograma de grosor de la vaina. (Control) Zoom Histograma de grosor de la vaina. (CIDP) Zoom Figura 7 Gráfico de diámetros del axón contra la razón G. (Control) Zoom Gráfico de diámetros del axón contra la razón G. (CIDP)
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión La valoración cuantitativa de las biopsias de nervio no se ha extendido al plano asistencial en la mayoría de los laboratorios. Esto se debe, posiblemente, a la carencia de recursos adecuados y a la falta de personal especializado con tiempo disponible para ello (7). En este trabajo, los valores de cada una de las variables morfométricas se confrontan con rangos de normalidad obtenidos de cortes semifinos (11,12,13,6,3,2). Esos valores se tomaron como referencia debido a la carencia de trabajos con preparaciones análogas a las nuestras. De acuerdo con valores de DNFM reportados en la literatura para adultos normales -entre 7500 y 10000 fibras/mm² - (11,12), 10 controles de esta serie presentan valores ligeramente inferiores. Sin embargo, Bosboom y colaboradores (14) obtuvieron valores normales entre 6000 y 7000 fibras/mm², más parecidos a los de nuestra serie. Otro autor (15) plantea que entre 10 y 60 años el límite inferior es 6074 fibras/mm². Atendiendo a ese último criterio, solo uno de nuestros controles está fuera de límites normales. En cambio, en el 100% de los casos de CIDP de esta serie los valores de la DNFM fueron tan bajos como 1608 fibras/mm². Estos bajos valores también han sido reportados por otros autores en CIDP (14) y en diferentes tipos de neuropatías (2). Por ejemplo, en el estudio realizado sobre la Neuropatía Epidémica que afectó a nuestro país a principios de la década del 90 (16), la DNFM alcanzó valores tan bajos como 132 y 529 fibras/mm², dramáticamente menores que los límites inferiores normales referidos en la literatura. El histograma suma de la variable DF en los controles se comportó de la misma manera que por caso, siguiendo una distribución bimodal. Los máximos reportados por Jacobs y Love (11) y por Behse (3) están entre 3-5μm el primero y el segundo entre 9-12μm, lo cual coincide bastante con nuestros hallazgos (Figura_4). Varios investigadores asumen que el límite entre fibras grandes y pequeñas está en 7μm (3,17,18,2,8). El histograma total de los controles de esta serie también nos permitió asumir el valor de 7μm como límite entre las dos subpoblaciones de fibras mielínicas. Es importante destacar que en esta serie de CIDP, a pesar de que la densidad de fibras mielínicas está muy por debajo de los límites normales, la proporción entre las fibras pequeñas y las grandes fue normal. Esto quiere decir que la disminución de la densidad no ocurre a expensas de un tipo de fibra en particular. El síndrome de CIDP se caracteriza por disminuir el grosor de las vainas de mielina. Sin embargo, no encontramos ningún trabajo de morfometría en CIDP que midiera la variable GV. En este trabajo se demuestra una disminución estadísticamente significativa del GV en pacientes, con respecto a una serie de controles. El carácter retrospectivo de esta investigación no permitió estudiar relaciones anatomo-clínicas, que sin duda hubieran sido de interés. Sin embargo, en contraposición a otros criterios (19), teniendo en cuenta los resultados de este trabajo, estimamos que se debe considerar la biopsia del nervio sural como un elemento importante para complementar el diagnóstico de la CIDP. CONCLUSIONES 1 El procesamiento histológico que se aplica en nuestro laboratorio es apropiado para el estudio histomorfométrico 2 La metodología de trabajo morfométrico que se aplica en nuestro laboratorio para los diagnósticos asistenciales es adecuada 3 En nuestros controles, las variables morfométricas se comportaron de manera muy similar a los valores reportados en la literatura 4 Los resultados histomorfométricos de este estudio han permitido enriquecer la caracterización histológica de la CIDP 5 El estudio histomorfométrico de la biopsia de nervio sural amplía y profundiza el diagnóstico anatomopatológico de la CIDP 6 A pesar de que el sistema necesita modificaciones, este trabajo constituye la primera prueba de la última versión de Digipat
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Bibliografia 1. Dyck PJ: Pathologic alterations of the peripheral nervous system in man. In: Dyck PJ, Thomas PK, and Lambert EH (eds). Peripheral neuropathy. W.B. Saunders Co. Philadelphia, 1975. Chapter 15. 2. Lindemuth R, Ernzerhof C, Schimrigk K.Comparative morphometry of myelinated nerve fibres in the normal and pathologically altered human sural nerve and tibial nerve. Clin. Neuropathol. 2002; 21(1):29-34. 3. Behse F. Morphometric studies on the human sural nerve. Acta Neurologica Scandinavica 1990; Suppl No. 132, Vol 82: 38p. 4. Vita G, Santoro M, Trombetta G, Leonardi L, Messina C. A computer-assisted automatic method for myelinated nerve fiber morphometry. Acta Neurol Scand 1992;85: 18-22. 5. Campadelli P, Cristina G, Fabio P. Automated morphometric analysis in peripheral neuropathies. Computers in Biology and Medicine 1999;29:147-156. 6. Torch S, Usson Y, Saxod R. Automated morphometric study of human peripheral nerves by image analysis. Path. Res. Pract. 1989;185,567-571. 7. Coro Antich RM, Domínguez Alvarez C. Más allá del diagnóstico visual. Revista Cubana de Avances Médicos 1998; 13:60 -63. (Cuba) 8. Corkidi G, Ruiz-Velasco S, Ortiz A, Vargas G, Teixeira F. Limits of variation of fiber distribution in the sural nerve of man. Archives of Medical Research 1997;28(2):183-187. 9. Coro RM, Galarraga J, Gómez H, Gil X. Nuestra experiencia en la informatización del Laboratorio de Anatomía Patológica. Curso precongreso de Neuropatología del evento por el 40 aniversario del Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana, Cuba. Enero de 2002. 10. Coro RM, Borrajero I. DIGIPAT. Un sistema cubano para morfometría de imágenes. Revista Latinoamericana de Patología 1996; 34 (1): 9-1. 11. Jacobs J., Love S. Qualitative and quantitative morphology of human sural nerve at different ages. Brain, 1985; 108: 897 – 905. 12. Labrousse F. La biopsie nerveuse au cours de neuromyélopathies tropicales. A propos de 29 observations. Thése pour le diplome d’état de docteur en médecine. 1986. Université de Limoges.Limoges , France. 13. Usson Y, Torch S, Drouet d´ Aubigny G. A method for automatic classification of large and small myelinated fibre populations in peripheral nerves. Journal of Neuroscience Method 1987; 20: 237-248. 14. Bosboom WMJ, Van den Berg LH, Franssen H, Giesbergen PCLM, Flach HZ, Van Putten AM, Veldman H, Wokke JHJ. Diagnostic value of sural nerve demyelination in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Brain 2001; 124:2427-2438. 15. Ohnishi A, Ikeda M, Yamamoto T, Murai Y, Yoshimura T. Morphometric analysis of normal human sural nerves for systematic clinical application. J. UOEH 1991; 13(2):103-108. 16. Borrajero I, Pérez JL, Domínguez C, Chong A, Coro RM, Rodríguez H, Gómez N, Román L. Epidemic neuropathy in Cuba: Morphological characterization of peripheral nerve lesions in sural nerve biopsies. J. Neurol. Sci. 1994; 127:68-76. 17. Bradley WG, Shapshak P, Delgado S, Nagano I, Stewart R, Rocha B. Morphometric analysis of the peripheral neuropathy of AIDS. Muscle Nerve 1998; 21:1188-1195. 18. Herrmann DN, Griffin JW, Hauer P, Cornblath DR, McArthur JC. Epidermal nerve fiber density and sural nerve morphometry in peripheral neuropathies. Neurology 1999;53:1634-1640. 19. Andrade R, González I, Machado A, García A. ¿Puede la biopsia de nervio sural orientar el tratamiento en la polineuropatía desmielinizante crónica inflamatoria? Rev Neurol 2001; 33(11):1005-9.