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CORDOMA. Un estudio histoquímico-inmunohistoquímico y ultraestructural en casos metastásicos.

Dr. Santiago Quintero Cayola , Dra Julia Cruz Mojarrieta , Dra Margarita Amigó de Quesada , Dr. Alejandro Joan Figueroa , Dra. Sirced Salazar Rodriguez , Dr. René Guernaluce Brooks y Dr. Julio Jiménez Galaimena

Departamento de Anatomía Patológica. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Ciudad Habana.

Cuba
 Resumen
El cordoma, un tumor poco frecuente en nuestro medio, desarrollado a expensas de restos notocordales en los discos intervertebrales y cuerpos vertebrales, 50% sacrocoxígeos, 35% esfenoccipitales y poco frecuentes en otras localizaciones generalmente del esqueleto axial, en ocasiones retrorectales, poco metastizantes, esta condición y la existencia entre sus componentes de sustancia mixoide han sido motivos para el estudio HQ, IHQ y Ultraestructural para la diferenciación con otros Tumores Mixoides como el antiguamente denominado Sarcoma Cordoide. Presentamos tres casos de Cordomas con metástasis en los que la presencia de Keratan sulfato en el Cordoma y no de Condroitin sulfato contribuvó con la IHQ para la diferenciación entre estos y otros Tumores Mixoides, la ME de los Cordomas estudiados no arrojó cambios con respecto a los no metastizantes.
 Introducción
Los Cordomas son neoplasias poco frecuentes originadas en restos de la notocorda que persisten en la columna vertebral. La principal característica de malignidad de estos tumores es su localización (1,2), ubicados en las vértebras y discos intervertebrales, predominan en la región sacrocoxígea (48%) y esfeno-occipital (39%), con rareza pueden aparecer en la columna móvil (3), en costillas u otros huesos, pero su aparición en otras localizaciones se está reportando con mayor frecuencia; de lento crecimiento, recurrentes y poco metastizantes a pesar del número de casos reportados se está incrementando (2,4,5,6).

Los Cordomas son masas lobuladas de aspecto encapsulado, semitranslúcidas de color gris o gris amarillento, gelatinosas, a veces pueden ser confundidos con tumores cartilaginosos que aparezcan en sus localizaciónes habituales(7). Están constituidos por células de abundante citoplasma y aspecto en anillo de sello, inmersas en una matriz mucinosa y células fisalíferas dispuestas en cordones y sincitios. La actividad mitótica es poco frecuente y el pleomorfismo, cuando está presente es irrelevante y sin gran significación pronóstica(2). El hecho de que autores en casos estudiados por ellos encontraran una mezcla de elementos cordoides y condroides les llevó a llamarles Paracordomas(8) y Cordomas condroides(9) los cuales han sido motivo de inquietud para muchos autores(10,11,12,13,14). Sin embargo el diagnóstico diferencial debe ser establecido con los Condrosarcomas incluyendo al de células claras y al Sarcoma cordoide, en la actualidad conocido como Condrosarcoma mixoide extraesquelético(10,15). Si bien es cierto que hoy la Inmunohistoquímica (IHQ) tiene un papel preponderante en el diagnóstico,(10,11,13,14,16,17) no es menos cierto que estos tumores poseen una matriz mucinosa cuyas características están presentes en otras neoplasias mixoides y que en los Cordomas ha sido poco estudiada en detalle por métodos bioquímicos(18) e histoquímicos(2), esta matriz está constituida por Glicosaminoglicanos (GAG) y Proteoglicanos (PG), que consideramos pudieran tener valor en el comportamiento metastizante de nuestros casos, en el diagnóstico diferencial con los Condrosarcomas y en particular entre el "Sarcoma cordoide" actualmente denominado Condrosarcoma mixoide extraesquelético.
 Material y Métodos
Material de biopsias de 3 casos de Cordomas del sacro, 3 de Condrosarcomas y 3 de Osteocondromas se tomaron para un estudio comparativo de distribución de Mucopolisácaridos (MPS). Las muestras fueron fijadas en formol neutro y embebidas en parafina, los cortes histológicos obtenidos fueron teñidos con H/E, PAS-diastasa, PAS-0.1% Azul Alcian, 0.1% Azul Alcian pH 2 en ácido acético al 3% y pH 1 en ácido clorhídrico 0.1 N , Azul de Toluidina 0.05 M pH 3.5 en buffer Mc Ilvaine y pH 1.5 y pH 0.5 en ácido clorhídrico 0.1 N y 0.5 N respectivamente con y sin tratamiento previo con hialuronidasa (1 mg/ml de cloruro de sodio 0.85%) por 3 horas a 37º C y Azul de Toluidina en etanol al 70%. También metilación moderada e hidrólisis ácida se efectuó como reacción bloqueadora.

El tejido para Microscopía Electrónica (ME) se fijó en glutaraldehido al 3.25% en buffer fosfato pH 7.3 a 4º C durante 1 hora, se realizó fijación secundaria en tetróxido de osmio al 2% e igual buffer por 1 hora a 4º C, se deshidrató en etanol de gradación ascendente y embebido en Durcupan ACM. Los cortes ultrafinos se realizaron en Ultramicrótomo Ultratom LKB III los cuales después de recibir post contraste en acetato de uranilo y citrato de plomo, fueron examinados en un ME Hitachi.

En el estudio Inmunohistoquímico (IHQ) se realizaron determinaciones de Vimentina, CK, EMA, CEA, proteína S-100 por considerar que eran estas las que mayor valor diagnóstico ofrecían.
 Resultados
El tejido tumoral en nuestros casos de Cordoma estuvo caracterizado por múltiples lóbulos de tamaño variable; bandas de fibras colágenas delimitaban a matriz mixoide donde se encontraron células aisladas o en grupos. Las células de formas estrelladas, fisalíferas, en anillo de sello y alargadas dispuestas en cordones o en aparentes sincitios las encontramos hacia la periferia de los lóbulos. Los núcleos en general de cromatina laxa, variables en tamaño y forma, dobles en algunas células, algunos mostraban indentaciónes, nucleolos prominentes y en los de gran tamaño fue posible en ocasiones observar seudoinclusiónes. (Figura_1, Figura_2, Figura_3 y Figura_4)

Al ME, dos tipos de células tumorales fueron observadas, unas de forma estrellada, dispuestas en bandas o grupos situadas en grandes lagunas de material electrón transparente y otras de mayor tamaño con abundante citoplasma con grandes vacuolas de contenido homogéneo, los núcleos de contornos irregulares frecuentemente con proyecciones citoplasmáticas, bolsas y cuerpos nucleares, en algunos núcleos pudimos observar la presencia de un gran nucleolo. En el citoplasma observamos abundantes ribosomas libres, polisomas, retículo endoplásmico (RER) y manojos de microfilamentos, las mitocondrias eran relativamente grandes con pocas crestas (Figura_5 y Figura_6).

La Inmunohistoquímica (IHQ) fundamental en la actualidad para la diferenciación entre el Cordoma y los tumores de origen cartilaginoso, resultó positiva para CK en el Cordoma y negativa para los tumores cartilaginosos estudiados, adicionalmente hubo positividad en el Cordoma para EMA y CEA y débil para proteína S-100 en tanto que los tumores de origen cartilaginoso fueron positivos para proteína S-100 y negativo para marcadores epiteliales, lo cual ha sido reportado por otros autores(10,11,13,14,17).

El análisis histoquímico puede verse resumido en la Tabla 1 y muestra que las células de los Cordomas contienen abundante glicógeno, pero no contiene GAG, mientras que la matriz tumoral es teñida con Azul Alcian. La tinción con Azul de Toluidina a pH 3,5 mostró intensa metacromasia en la matriz, esta metacromasia puede disminuir con valores de pH más bajos y con pre tratamiento con hialuronidasa testicular. Sin embargo a pH 1, una débil metacromasia se observó en secciones que recibieron este tratamiento previo. La intensidad de las reacciones del Azul Alcian y del Azul de Toluidina, no fue afectada por la hidrólisis ácida y la metilación moderada.

En los Condrosarcomas que estudiamos, no detectamos positividad para glicógeno, ni en las células ni en la matriz mucinosa, pero ambos fueron teñidos intensamente por el Azul Alcian a pH 2 y 1; también mostraron intensa metacromasia con Azul de Toluidina, no afectada por los diversos valores de pH utilizados (3,5; 1 y 0,5), el pre tratamiento con hialuronidasa, la hidrólisis ácida, ni la metilación moderada.

En cuanto al Osteocondroma el contenido de glicógeno fue negativo pero la metacromasia disminuyó a pH 1,5 tanto en las células cartilaginosas como en la matriz y a pH 0,5 solo una débil metacromasia se observó en la matriz. El pre tratamiento con hialuronidasa afectó las reacciones del Azul de Toluidina disminuyendo la intensidad a la mitad de su valor aproximadamente. Esta tinción no fue afectada por la hidrólisis ácida, ni por la metilación moderada.

Tabla 1
REACTIVOS CORDOMA CONDROSARCOMA OSTEOCONDROMA
CÉLULAS MATRIZ CELULAS MATRIZ CÉLULAS MATRIZ
PAS +++ - - -
PAS - DIASTASA - - - -
ALCIAN BLUE pH2 - +++ +++ +++ +++ +++
ALCIAN BLUE Ph1 - ++ +++ +++ + +
AZUL TOLUIDINA pH 3,5 - +++ +++ +++ +++ +++
AZUL TOLUIDINA pH 3,5 + HIALURONIDASA - + +++ +++ ++/+ ++/+
AZUL TOLUIDINA Ph 1,5 - ++ +++ +++ + +
AZUL TOLUIDINA Ph 1,5 + HIALURONIDASA - + +++ +++ + +
AZUL TOLUIDINA pH 0,5 - +/- +++ +++ - +/-

Imagen de CORDOMA. Un estudio histoquímico-inmunohistoquímico y ultraestructural en casos metastásicos.Zoom
Corte histológico de menor aumento de uno de los casos de Cordoma estudiados donde puede observarse las células tumorales, algunas presentan citoplasma con vacuolas pequeñas (células fisalíferas) y otras de citoplasma más homogeneo, presencia de abundante sustancia mixoide.
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Vista a mayor aumento de otro campo del tumor donde puede observarse con mayor claridad el aspecto de las células fisalíferas, las células con citoplasma más acidófilo no vacuolado y la sustancia mixoide.
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Microfotografía de un corte de uno de los Cordomas estudiados donde puede apreciarse hacia el límite superior izquierdo una banda de tejido fibroso que delimita en parte al tumor, compuesto por células dispuestas como en bandas que rodean en parte la sustancia mixoide.
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Otra microfoto a mayor aumento donde puede observarse aún mejor la morfología celular descrita con vacuolas citoplasmáticas que a algunas le confieren aspecto en anillo de sello, los núcleos son prominentes, irregulares e hipercomáticos.
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ME de una célula de Cordoma: En el citoplasma la flecha indica RER y la V vacuolas citoplasmáticas. El núcleo ligeramente indentado presenta nucleolo notable NU y cuerpos nucleares, CP.
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ME de otra célula tumoral con gran núcleo indentado presencia de cuerpo nuclear, NB; proyecciones nucleares, NP y en el citoplasma, retículo endoplásmico rugoso, RER.
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La Tinción con PAS demuestra la presencia de glicógeno en el citoplasma de la célula y no en la matriz de los Cordomas, apréciese el contraste entre el citoplasma y la sustancia mixoide intra y extracelular. Ver Tabla I.
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La Tinción con PAS demuestra la presencia de glicógeno en el citoplasma de la célula y no en la matriz de los Cordomas, apréciese el contraste entre el citoplasma y la sustancia mixoide intra y extracelular. Ver Tabla I.
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La Tinción con PAS demuestra la presencia de glicógeno en el citoplasma de la célula y no en la matriz de los Cordomas, apréciese el contraste entre el citoplasma y la sustancia mixoide intra y extracelular. Ver Tabla I.
 Discusión
El contenido de glicógeno en el citoplasma de células del Cordoma ha sido bien definido(2) (Figura_7, Figura_8 y Figura_9). Aunque muchos autores reportan que estas células yacen en una matriz mixoide, el contenido y distribución de GAGs y PGs no ha sido estudiado en detalle. Nuestros resultados son compatibles con la presencia de hialuronato y Condroitín sulfato en la matriz tumoral. Keratán sulfato y Dermatán sulfato (condroitin sulfato B) podrían estar presentes ya que el Azul de Toluidina a pH 3,5 tiñe al hialuronato, Condroitín sulfato y Keratán sulfato, pero el Condroitín 4-sulfato o (A) y 6-sulfato o (C), son sensibles a la hialuronidasa, por lo que la metacromasia residual puede corresponder a Condroitín sulfato B (Dermatán sulfato) ó a Keratán sulfato (acorde con la Clasificación de Ganter y Jolles).

Estos hallazgos están de acuerdo con lo reportado por Sweet y cols(18) en un caso estudiado por métodos bioquímicos, solo que el análisis de los subtipos de Condroitín sulfato no fue hecho por ellos.

Como en los Cordomas se puede encontrar áreas de diferenciación condroide, el hecho de que las células de los Condrosarcomas y Condromas carezcan de glicógeno puede ser de valor para establecer diagnóstico diferencial entre estos tipos de tumores.

En el disco intervertebral inmaduro se encuentra relativamente poco hialuronato y Keratán sulfato y se plantea que el contenido de éstos GAGs se eleva con la maduración y con la edad. En nuestros casos de Cordoma y en el reportado por Sweet se observó relativamente poco contenido de hialuronato y de Keratan sulfato. Esto puede apuntar hacia un grado mayor de inmadurez y de indiferenciación funcional del tumor que podría tenerse en cuenta para considerar que en estos casos existe un mayor potencial de metastización.

En el cartílago normal los GAGs están constituidos por las formas 4-s y 6-s del Condroitín sulfato, Ácido hialurónico y Keratán sulfato.
Con respecto a los Condrosarcomas se ha visto que el Condroitín sulfato constituye un por ciento elevadísimo de la matriz tumoral y predomina la forma 4-s ó Condroitín sulfato A, solo un pequeño por ciento corresponde a Ácido hialurónico en tanto que el Keratan sulfato y el Condroitín 6-sulfato ó C están reducidos al mínimo.

Los casos de Condroma presentaron un contenido aproximadamente igual de Keratán sulfato, Condroitín sulfato y Hialuronato, lo cual es compatible con la presencia d una matriz cartilaginosa mas diferenciada.

La IHQ realizada a nuestros casos de Cordomas resultó positiva para CK lo cual concuerda con Mitchell y cols(14) que reportaron CK positiva en todos los casos de Cordomas, por ellos estudiados y en 8 de 25 casos de Cordomas condroides. O’Hara y cols(19) estudiaron subtipos de CK y hallaron positividad para K8 y K19, casi siempre para K5 y esporádicamente para K7 y K20, en tanto que en los tumores cartilaginosos la CK es negativa.

El estudio ultraestructural en los casos de Cordomas metastásicos demostró que los núcleos, tanto de las células estrelladas como de las fisalíferas con grandes vacuolas, presentaban características comparables con las reportadas por otros autores(2,13,15,16,17).
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