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Determinación de c.erbB-2/neu en cancer de mama: análisis comparativo de la determinación mediante análisis inmunoenzimático (ELISA) e inmunohistoquímico

Dra Maria L Lamelas Suarez-Pola1 , Dr Julio Vázquez 1 , Dr. Luis O González 2 , A Rodil 3 , Dra Paula Vérez 3 , Dr Francisco Vizoso 3 y Dr Pablo Raigoso 4

1 Servicio de Ginecología, 2 Anatomía Patólogica, 3 Cirugía General Hospital de Jove, Gijón.
4 Servicio de Medicina Nuclear del Hospital Central de Asturias, Oviedo. Asturias

España
 Resumen
El objetivo de este trabajo fue analizar prospectivamente la determinación de c-erbB-2 mediante ELISA e inmunohistoquímica en un grupo de 60 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama. Nuestros resultados mostraron una tinción positiva en un 45% de los tumores y una amplia variabilidad en el contenido citosólico y de membrana de c-erbB-2. Hubo correlación entre el contenido del receptor y la tinción inmunohistoquímica pero no observamos ninguna asociación entre las características de los tumores o de las pacientes y la determinación de c-erbB2. Además, se manifiesta la necesidad de futuras investigaciones que intenten explicar algunas discrepancias observadas.
 Introducción
El gen c-erbB-2 (Her2/neu) codifica una gluco-proteína (p185) que actúa como receptor de membrana celular con una actividad tirosin-quinasa. Sus ligandos exactos son controvertidos pero están relacionados con factores de crecimiento, diferenciación, motilidad y adhesión celular. La amplificación o sobre-expresión de este gen se ha descrito en el 10-40% de los carcinomas de mama (1,2) y parece tener valor pronóstico además de influir en la respuesta al tratamiento quimioterápico (3,4,5).

Además, estudios recientes han demostrado la utilidad terapéutica de la determinación de la p185 con la utilización de anticuerpos monoclonales contra este receptor de membrana en aquellas pacientes que sobre-expresen la proteína. Sin embargo, hay problemas para establecer el mejor método que identifique esta sobre-expresión del c-erbB-2 en los tumores.

En este trabajo, nos propusimos analizar prospectivamente la expresión de c-erbB2 en un grupo de carcinomas de mama mediante inmunohistoquímica y cuantificar su contenido citosólico y de membrana mediante ELISA así como comparar los resultados de ambos métodos de determinación.
 Material y Métodos
Tomamos muestras tumorales consecutivas de 60 pacientes no seleccionadas y diagnosticadas de carcinoma ductal infiltrante de mama en el Hospital de Jove de Gijón entre los años 1998 y 2000.

Las muestras se procesaron en parte de forma rutinaria en parafina para estudio histológico y el resto se almacenó a –70º C para su posterior análisis bioquímico.

ANALISIS INMUNOHISTOQUÍMICO
La sobre-expresión del c-erbB2 se estableció analizando la presencia de p185 mediante técnica inmunohistoquímica siguiendo las instrucciones del kit comercial de DAKO (Carpenteria, CA USA) sobre secciones de parafina de 5 . La tinción se puso de manifiesto con diaminobencidina (DAB) y se utilizaron controles positivos y negativos en cada batería de análisis . La tinción fue evaluada por dos médicos anatomo-patólogos que desconocían la cuantificación de c-erbB2 y aplicaron la siguiente escala:

-0: no tinción
- +: tinción incompleta o débil de membrana (figura 1)
- ++: tinción completa de membrana en al menos el 10% de las células (figura 2)
- +++: fuerte tinción completa de membrana en la mayoría de las células (figura 3)

CUANTIFICACIÓN DE p185, RECEPTORES DE ESTRÓGENOS(RE) Y DE PROGESTERONA(RP)
La oncoproteína p185 se cuantificó en membrana y en citosol mediante técnica de ELISA (Oncogene Research products, Boston, MA-USA) que utiliza dos anticuerpos monoclonales. Los resultados se expresan en unidades NHU/mg de proteína homogeneizada.

Los RE y RP se determinaron en citosol utilizando un kit comercial de inmunoanálisis basado en la técnica de “Sandwich” (Laboratorios Abbot, División de Diagnóstico , Wiesbaden, Alemania). Los tumores se consideraron positivos cuando el contenido citosólico de estos receptores era superior a 10 fmol/mg proteína.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 10.0. El contenido de p185 (HER2) se expresó como la mediana y su intervalo. Las diferencias en el contenido citosólico y de membrana de la oncoproteína se compararon utilizando el test de Wilcoxon para muestras pareadas. La asociación entre los niveles citosólicos y de membrana también se determinó mediante el test de Spearman. Las pacientes se clasificaron en grupos en función de las diferentes carácterísticas clínicas y patológicas. La comparación entre grupos del contenido de p185 se estableció mediante el test de Mann-Whitney o de Kruskall-Wallis. Las diferencias entre porcentajes se analizó mediante el test de 2 . El nivel de significación estadística se estableció como p< 0,05.
 Resultados
c-erbB2 por inmunohistoqímica (IHC)
Las figuras 1,2 y 3 Figura_1,Figura_2Figura_3 representan tumores con tinción positiva para la oncoproteína p185. Una intensidad de tinción de ++/+++ se observó en 27 de los 60 casos (45%). De los tumores positivos, 17 (28%) presentaron una puntuación de ++ y 10 (16%) de +++.

c-erbB2 por ELISA
La cuantificación del contenido de p185 mostró una gran variabilidad, tanto en membrana (704-80000 NHU/mg de prot) como en citosol (230-49881 NHU/mg de prot). Como era de esperar, el contenido de membrana fue significativamente superior en membrana (mediana: 4656 NHU/mg prot) que en citosol (mediana: 823 NHU/mg prot) (p<0,0001). Además, hubo correlación positiva entre ambos compartimentos (n=60; r sub S= 0,7; p<0,01) Figura_4

IHC versus ELISA
La tinción IHC de p185 mostró una relación significativa y positiva con el contenido de membrana (p=0,015) y de citosol p=0,001) determinado por ELISA. Tabla_2. Las tablas 3 y 4 muestran la relación que observamos entre la tinción IHC de p185 y los niveles de la oncoproteína por ELISA distribuidos en cuartiles. Se puede observar que hay una relación significativa entre la tinción IHC y la distribución en cuartiles del contenido citosólico de p185 (p=0,014; tabla_4) pero no del contenido de membrana tabla_3. Además, hubo un número significativo de tumores que presentaban una discordancia entre de resultados entre la IHC y ELISA. Así, 5 de 15 casos (33%) pertenecientes al percentil 25 del contenido de membrana de p185 tenían tinción positiva para la proteína, mientras que 4 de 15 tumores (26%) del grupo mayor del percentil 75 presentaban inmunotinción negativa. De forma similar, hubo discordancia en el 9-205 de los casos entre el contenido citosólico de p185 y su inmunotinción tabla_4.

Correlación de IHC y ELISA con los parámetros clínicohistológicos
Los resultados obtenidos no muestran ninguna relación entre la presencia de p185, tanto por IHC como cuantificado por ELISA, con las características de las pacientes o de los tumores como la edad, tamaño tumoral, grado histológico o contenido de receptores de estrógenos o de progesterona Tabla_1
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Figura 1. Tinción inmunohistoquímica (+)cerbB2/neu en un carcinoma de mama (400x)
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Figura 1. Tinción inmunohistoquímica (++)cerbB2/neu en un carcinoma de mama (400x)
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Tinción inmunohistoquímica (+++) de c-erbB2/neu en un carcinoma ductal infiltrante de mama (400x)
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Correlación entre los niveles citosólicos y de membrana de cerbB2/neu en 60 carcinomas de mama (p<0,001)
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Características de las pacientes y de los tumores y su relación con los niveles de p185 (HER2/neu)determinados por ELISA y por IHC
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Relación entre la inmunotinción de p185 (HER-2/neu) y sus niveles determinados por ELISA
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Relación entre los valores de p185 por IHC y su contenido en membrana determinado por ELISA (divididos en 4 grupos utilizando como nivel de corte los percentilres 25º,50º y 75º).
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Relación entre los valores de p185 por IHC y su contenido en citosol determinado por ELISA (divididos en 4 grupos utilizando como nivel de corte los percentilres 25º,50º y 75º).
 Discusión
DISCUSIÓN

Este trabajo muestra que existe una amplia variabilidad en el contenido citosólico y de membrana del a p185 (HER2/neu) cuantificada mediante ELISA en los carcinomas de mama, así como que hay una correlación positiva entre ambos compartimentos. Además, también se demuestra una correlación positiva entre el contenido de esta oncoproteína y su determinación mediante inmunohistoquímica (IHC). Sin embargo, hubo un número significativo de tumores que presentaban resultados discordantes entre la técnica de ELISA e IHC.

La amplificación del gen c-erbB2 está descrita en un 10-40% de tumores de mama (1,2) pero hay un número importante de tumores que presentan niveles elevados de la oncoproteína p185 sin mostrar amplificación génica porque lo que está incrementado es el proceso de trasncripción (6,7). Por ello, es importante clínicamente la determinación de la p185 para la toma de decisiones terapéuticas.

La IHC es la técnica más ampliamente utilizada para este fin porque es fácilmente realizable en cualquier laboratorio de anatomía patológica además de realizarse sobre las muestras tumorales de parafina. También es muy útil porque mantiene la arquitectura histólogica del tumor pudiendo localizar la ubicación de la proteína en estudio. La tinción para la p185, como proteína transmembrana que es, se localiza en la membrana celular de forma intensa (señal ++/+++) en un 20-30% de los carcinomas de mama (8) siendo un criterio para tratamiento de esas pacientes con Herceptina. En nuestro trabajo identifcamos un porcentaje ligeramente superior de tumores (45%) con positividad para la p185. Sin embargo, no hay estudios controlados que sirvan para estandarizar la interpretación de la tinción IHC o establecer el nivel corte clínicamente relevante.

Otro método de determinar la presencia de p185 en los tumores es cuantificar su contenido en el citosol de tejido fresco mediante la técnica de ELISA. Esta técnica evita los inconvenientes derivados de la fijación y almacenamiento incontrolado de los tejidos. Se ha demostrado en diferentes estudios que los niveles de p185 (HER2/neu) en los carcinomas de mama se correlacionan con factores de mal pronóstico como la ausencia de receptores de estrógenos (9), mal grado de diferenciación (10) o altos niveles de catepsina D (11). En nuestro estudio no observamos relación entre el contenido citosólico de p185 (HER2/neu) y las características clínicopatologicas de los tumores mamarios. Sin embargo, observamos una gran variabilidad en los niveles de la oncoproteína lo que refleja la gran heterogeneidad de estos tumores. Aunque el contenido de membrana de p185 ha sido poco investigado, nuestras determinaciones también muestran una gran variabilidad y, como era de esperar, los niveles fueron significativamente más elevados que los del citosol. Además, hubo una correlación positiva en el contenido de p185 entre ambos compartimentos, lo que sugiere que hay una relación biológica entre ellos. Tampoco observamos ninguna relación entre el contenido de membrana de p185 y los parámetros clinicohistológicos. Sin embargo, Eppenberg-Castori et al. (12) han descrito una menor supervivencia para las pacientes con tumores que presentaban un mayor contenido de membrana p185 cuantificado mediante ELISA.

La tinción IHC y la cuantificación de la p185 (HER2/neu) mediante ELISA rara vez se realiza simultáneamente. Los pocos estudios publicados muestran una buena correlación entre ambas técnicas (12,13,14,15,16). De forma similar, nuestro estudio muestra una correlacion significativa y positiva entre la tinción IHC y los niveles citosólicos de p185 distribuidos en cuartiles. Sin embargo, apreciamos resultados discordantes entre ambas técnicas en un número significativo de casos. Además, no hubo correlación entre la tinción IHC y la distribución en cuartiles de los niveles de membrana de p185.

Hay varias explicaciones para estas discrepancias entre la técnica IHC y ELISA. La IHC presenta dos problemas mayores. Por una parte, puede mostarse insuficiente en ocasiones por la pérdida de sensibilidad secundaria a la alteración de epitopos sifrida durante la fijación estándar de los tejidos (10,11). Por otra parte, está documentada la variabilidad en la sensibilidad (6 a 80%) de los anticuerpos disponibles en el mercado (17). Otra limitación importante de esta técnica es el carácter subjetivo de su interpretación (8). En cuanto al técnica de ELISA, es importante considerar la contaminación de la muestra con tejido conectivo no celular que puede diluir los niveles de p185.

En resumen, nuestros resultados mustran una relación significativa entre la determinacion de p185 (HER2/neu) mediante IHC y ELISA. Sin embargo, un número importante de tumores presentaron resultados discordantes. Estas discrepancias pueden deberse a variables metodólógicas o técnicas. Por ello, consideramos que se necesitan más estudios que investiguen si la combinación de IHC y ELISA puede aportar más precisión en la determinación de la p185 (HER2/neu) en el cáncer de mama.
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