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Página Principal Comunicaciones	Estudio Inmunohistoquímico y cuantitativo de las células neuroendocrinas de la próstata de la rata a lo largo del desarrollo postnatal Prof. José Manuel Pozuelo González1 , Dra. Rosario Rodríguez Ramos1 , Dra. Rocío Martín López2,3 , Dra. Riánsares Arriazu Navarro1 y Prof. Luis Santamaría Solís3 1. Departamento de Biología Celular, Facultad de Ciencias experimentales y de la Salud. Universidad de San Pablo. Madrid. España. 2. Servicio de Patología (Anatomía Patológica). Hospital N.Sra. de Sonsoles. Ávila. España. 3. Departamento de Morfología (Histología), Facultad de Medicina, UAM. Madrid. España. España
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen INTRODUCCIÓN: Las células neuroendocrinas constituyen una subpoblación celular cuyo papel en la próstata es poco conocido. La presencia de determinadas sustancias de naturaleza peptídica en su citoplasma, inducen a pensar en su intervención sobre la secreción, crecimiento y mantenimiento de la glándula. En los últimos años se plantea su implicación en el desarrollo de las patologías prostáticas como son la hiperplasia benigna y el cáncer de próstata. El objetivo de este trabajo consiste en cuantificar la presencia y distribución de las células neuroendocrinas en la próstata de la rata durante el desarrollo postnatal. MATERIAL Y MÉTODOS: 60 ratas Wistar macho, distribuidas en cuatro grupos: prepuberales, puberales, adultos jóvenes y adultos viejos. Como marcadores inmunohistoquímicos neuroendocrinos se utilizaron serotonina y PGP 9.5. La cuantificación del número de células inmunorreactivas para serotonina se realizó mediante técnicas estereológicas (disector óptico). RESULTADOS: Las células neuroendocrinas observadas son inmunorreactivas para serotonina y no expresan PGP 9.5. Aparecen a los 9 días de desarrollo postnatal y se localizan exclusivamente entre las células epiteliales de los conductos prostáticos periuretrales. En la pubertad se observa un incremento significativo del número relativo de células. Sin embargo, el mayor número absoluto aparece en los adultos jóvenes. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: Estas variaciones en los números relativo y absoluto de células neuroendocrinas a lo largo del desarrollo podrían relacionarse con la actividad androgénica que se intensifica en la pubertad, se mantiene constante durante la madurez sexual de los adultos jóvenes para decrecer en la senectud. La localización exclusiva de células neuroendocrinas en los conductos periuretrales prostáticos sugiere su intervención en la regulación de procesos de excreción del fluido prostático.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción Las células neuroendocrinas constituyen una subpoblación celular, cuya función en la patofisiología prostática es aún bastante desconocida. Estas células podrían jugar un importante papel en el desarrollo de la hiperplasia benigna prostática (HBP) (1,2) y en el cáncer de próstata (3-6). Además, la diferenciación neuroendocrina podría estar relacionada con la falta de respuesta a la terapia por bloqueo androgénico que acontece en los estadios más avanzados del cáncer, los cuales siempre indican un peor pronóstico (6). Mc Neal describe la presencia de células neuroendocrinas en la próstata humana en tres regiones prostáticas que son: zona de transición, zona central y zona periférica (2). Estas células se localizan entre las células epiteliales de los acinos y de los conductos y son más abundantes en las zonas de transición y periuretrales que en el resto de las regiones (2,7,8). Su morfología típica, con prolongaciones dendríticas que se extienden entre las células epiteliales vecinas, sugiere que las células neuroendocrinas intervengan regulando las funciones de crecimiento y secreción glandular mediante mecanismos de tipo autocrino y/o paracrino (9). Se han detectado un gran número de neuropéptidos y otras sustancias de diversas naturalezas, en estas células como son: serotonina (9-11), cromograninas A y B, secretogranina (12), enolasa neuroespecífica (11), gen relacionado con el péptido de la calcitonina (CGRP), katacalcina, paratohormona, péptido relacionado con la bombesina (13-15), calcitonina (13,16), somatostatina (17), protein gene product 9.5, neuropéptido Y (NPY) (18), y sinaptofisina (18,19). Aunque existen importantes diferencias entre la próstata humana y la próstata de rata, la próstata de la rata ha sido ampliamente usada como modelo experimental para estudiar la biología y la patofisiología de esta glándula (20-22). Al igual que ocurre en la próstata humana, en el epitelio prostático de la rata se han encontrado células principales y basales. Las células principales son secretoras y pueden proliferar y las células basales son escasas y también se dividen (23). Sin embargo, la presencia de células neuroendocrinas en la próstata de la rata ha estado bastante controvertida (24). Hay estudios que describen su presencia y función (20,25), otros describen diferentes subpoblaciones que expresan diferentes antígenos (25) y, otros que intentan relacionar el desarrollo neuroendocrino con el estado androgénico (24). Por todo ello, sería interesante estudiar los cambios cuantitativos ocurridos en la población neuroendocrina presente en la próstata de la rata durante el desarrollo postnatal. Con este planteamiento se pretende estudiar: la presencia, distribución y número de células neuroendocrinas en la próstata de la rata a lo largo del desarrollo postnatal mediante la detección inmunohistoquímica de serotonina (SER) y protein gene product 9.5 (PGP 9.5).
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Animales Para los estudios inmunohistoquímicos y esterológicos se han utilizado 40 ratas Wistar macho. Los animales se agruparon en los siguientes 4 estadios de acuerdo al desarrollo postnatal (10 ratas / grupo): prepuberales (15 días), puberales (30 días), adultos jóvenes (90 días) y adultos viejos (540 dias). Los animales fueron tratados de acuerdo a las normas de ética adoptadas por la Sociedad para los Estudios de Reproducción. Todas las ratas fueron sacrificadas tras narcosis profunda con CO2 . El complejo prostático fue cuidadosamente diseccionado de la cavidad abdominal de cada animal, y su volumen total en fresco (Vprost) fue determinado mediante el desplazamiento de agua que la pieza producía al sumergirla en el interior de una probeta graduada. A continuación, el complejo prostático fue cortado exhaustivamente en rodajas de 2 mm de espesor. El plano de sección fue perpendicular al eje sagital de la glándula. Todas las muestras fueron fijadas por inmersión en paraformaldehído al 4% en buffer salino fosfato (PBS) pH: 7.4 durante 24 horas y posteriormente incluidas en parafina. Procedimiento de muestreo Todas las rodajas obtenidas de cada próstata fueron incluidas en parafina en un solo bloque. Después todos los bloques fueron seccionados seriadamente a 5micras de espesor, para la aplicación de las técnicas inmunohistoquímicas, y a 10 micras de espesor para los estudios estereológicos. En cada sección iban incluidas todas las regiones prostáticas. Para la evaluación de los resultados inmunohistoquímicos y estereológicos, fueron seleccionadas 5 secciones mediante muestreo sistemático al azar de cada uno de los bloques obtenidos de cada animal (26,27). Método inmunohistoquímico Las secciones una vez desparafinadas y rehidratadas fueron tratadas durante 30 minutos con peróxido de hidrógeno al 0.3% en PBS pH 7.4 con el fin de bloquear la peroxidasa endógena. Para detectar inmunorreactividad frente a SER, y PGP 9.5, las secciones fueron incubadas respectivamente con anticuerpo anti serotonina ( policlonal, Biomeda, Foster city, CA, USA, dilución 1/25) y con anticuerpo anti PGP 9.5 (monoclonal, Biomeda, dilución 1/25). Todos los antisueros primarios se diluyeron en PBS pH 7.4 que contenía una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% más azida sódica al 0.1%. Las secciones con el anticuerpo primario, se incubaron durante toda la noche a 4ºC. En el caso de anticuerpos primarios monoclonales, se utilizó un anticuerpo secundario que consistió en una inmunoglobulina biotinilada anti-ratón obtenida en cabra (Biomeda). Para los anticuerpos primarios policlonales, el anticuerpo secundario utilizado fue una inmunoglobulina biotinilada anti-conejo obtenida en cabra (Biomeda). Ambos, se diluyeron a una concentración de 1/400 en PBS que contenía una solución de BSA al 1% sin azida sódica. El tiempo de incubación de las secciones con los anticuerpos secundarios fue de 30 min a Tª ambiente. Por último, las secciones fueron tratadas con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (Biomeda) e incubadas de nuevo durante 30 min a Tª ambiente. La inmunorreacción fue revelada con una solución que contenía 0.1 g de diaminobencidina (DAB) (3,3’,4,4’ – tetraminobiphenyl, Sigma, St Louis, USA), más 40 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. El contraste nuclear se consiguió con Hematoxilina de Harris. Por último, los cristales se deshidrataron a través de una serie creciente de alcoholes, y se montaron con una resina sintética (Depex, Serva, Heidelberg, Germany). La especificidad de todas las reacciones inmunohistoquímicas fue comprobada mediante incubación de las secciones con suero no inmune como sustituto del anticuerpo primario. Evaluación de la densidad numérica de células neuroendocrinas La estimación de la cantidad de células neuroendocrinas se realizó solamente sobre aquellas células que eran inmunorreactivas para SER ya que, no se observaron células inmunorreactivas para PGP 9.5. El método empleado para la cuantificación de células neuroendocrinas fue el del disector óptico, un método estereológico no sesgado (28-30). Básicamente, para la realización de esta técnica estereológica se utilizaron las secciones de 10 mm inmunorreactivas para SER por próstata (o sea por animal) que se escogieron por muestreo sistemático al azar. La técnica del disector óptico exige este espesor de la sección (29). Con el fin de contar las células se delimitaron todas las regiones prostáticas y se delimitaron aproximadamente 100 campos por sección mediante muestreo sistemático al azar. Todas las medidas fueron realizadas mediante un microscopio Olympus con que poseía un objetivo de inmersión X 100 con una apertura numérica de 1.4 y una magnificación final de X 1200. El microscopio estaba conectado a una videocámara además de tener una platina motorizada conectada a un ordenador Commodore Amiga 2000. El software utilizado (Stereologic Software Package, GRID; Interactivision, Silkeborg, Denmark) 31 intervenía en el movimiento en dirección XY de la platina y permitía el muestreo sistemático al azar de los campos seleccionados. El programa generaba disectores que se superponían sobre la imagen capturada por la videocámara y los proyectaba sobre el monitor. El volumen del disector (Vdis) fue calculado según la fórmula: Vdis = Sd x Hd donde Sd = 1312 mm2 (área del disector), Hd= 5 micras (distancia entre los dos planos focales escogidos para determinar el volumen disector en la sección; esta distancia fue medida por un microcator – Heidenhain; Traunreut, Germany- conectado al desplazamiento del eje Z de la platina del microscopio). Como el espesor total de la sección era de 10 micras, se mantenía una distancia de seguridad de 2.5 mm por encima y por debajo de la sección óptica que prevenía de la producción de artefactos sobre la superficie física de la sección. De estos cálculos se deduce el Vdis = 6560 micras3 . Para elegir qué células neuroendocrinas contar se siguió la regla de Sterio (32); solamente se consideraban aptas para el recuento aquellas células que aparecían en el plano focal superior y que no eran observadas en el plano focal inferior de observación. Estas células elegidas para el recuento se designaron como Q d - . La densidad numérica o número de células inmunorreactivas para SER por unidad de volumen (NV SER) se obtuvo por la aplicación de la fórmula: NV = Sum Qd - / Sum Vdis x FR donde Sum Vdis = número total de disectores aplicados seleccionados en cada sección multiplicados por Vdis. NV se calculó como el número de células por mm3 de volumen prostático. El factor de retracción FR se trata de un parámetro que evalúa la retracción tisular experimentada por el tejido tras el procesamiento. Es necesario para convertir las magnitudes reales obtenidas sobre el tejido retraído – incluido en parafina – en las magnitudes reales de la próstata en fresco. En el caso de las próstatas de ratas Wistar, este parámetro es un valor constante y adimensional: 1.3 y procede del cociente que resulta al dividir el volumen de la próstata en fresco entre el volumen retraído. El volumen retraído se obtiene aplicando el Principio de Cavalieri. Evaluación del número de células neuroendocrinas por próstata El número absoluto de células neuroendocrinas inmunorreactivas para serotonina (N SER) fue calculado multiplicando el correspondiente NV SER por el volumen prostático en fresco.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados Inmunotinción para PGP 9.5 No se detectaron células neuroendocrinas inmunorreactivas para PGP 9.5 en ninguna región prostática ni en ninguno de los cuatro estadios del desarrollo estudiados. Inmunotinción para Serotonina Las células neuroendocrinas inmunorreactivas para SER fueron detectadas en todos los grupos de desarrollo. Estas células aparecían localizadas entre las células epiteliales columnares de los conductos prostáticos periuretrales. No se observó ninguna célula inmunorreactiva para SER entre el epitelio acinar del resto de las regiones prostáticas. En los animales prepuberales (fig. 1) tan solo se observan algunas células dispersas las cuales, se vuelven más abundantes durante la pubertad (fig. 2) para decrecer en la primera etapa de la madurez sexual (fig. 3) y más acusadamente en la senectud (fig.4). Estas células pueden tener forma redondeada o triangular y a menudo muestran prolongaciones dendríticas apicales (fig. 2). Cuantificación estereológica El volumen prostático se incrementó significativamente desde los animales prepuberales a los adultos viejos (fig.5). El NVSER aparecía significativamente incrementado (P< 0.05) en los animales puberales respecto a los prepuberales. Además, este parámetro también es significativamente superior en la ratas puberales respecto a los grupos de adultos tanto jóvenes como viejos. El NV SER en los animales adultos viejos disminuye a niveles similares a los observados en el grupo de los prepuberales (fig.6). El N SER aumentaba significativamente en los adultos jóvenes respecto al resto de grupos de desarrollo (fig.7). Zoom Fig.1 Figura 1. Conductos prepuberales procedentes de la próstata de una rata prepuberal. Se observan tres células inmunorreactivas para SER situadas entre las células epiteliales de los conductos todavía inmaduros. X400. Zoom Fig.2 Figura 2. Conductos periuretrales procedentes de la próstata de una rata puberal. La imagen muestra abundantes células que expresan SER, algunas muestran prolongaciones apicales. X 400. Zoom Fig.3 Figura 3. Conductos periuretrales procedentes de la próstata de una rata adulta joven. Se pueden observar con claridad dos células inmunorreactivas para SER. X 400. Zoom Fig.4 Figura 4. Conductos periuretrales procedentes de la próstata de una rata adulta vieja. Tan solo se observa una sola célula inmunorreactiva para SER. X 400. Figs.5,6,7 Figura 5. Diagrama de barras que indica el volumen prostático total en fresco (mm3), expresado por la media ± SD, en ratas prepuberales (PP), puberales (P), adultas jóvenes (AJ) y adultas viejas (AV). Las barras afectadas por letras distintas muestran diferencias significativas (p<0.05). Figura 6. Diagrama de barras que indica la densidad numérica de células neuroendocrinas inmunorreactivas para serotonina (NV SER: número de células/mm3 de tejido prostático), expresado por la media ± SD, en ratas prepuberales (PP), puberales (P), adultas jóvenes (AJ) y adultas viejas (AV). Las barras afectadas por letras distintas muestran diferencias significativas (p<0.05). Figura 7. Diagrama de barras que indica el número absoluto de células neuroendocrinas inmunorreactivas para serotonina por próstata (N SER), expresado por la media ± SD, en ratas prepuberales (PP), puberales (P), adultas jóvenes (AJ) y adultas viejas (AV). Las barras afectadas por letras distintas muestran diferencias significativas (p<0.05).
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión La presencia de células neuroendocrinas inmunorreactivas para SER ha sido confirmada en la próstata de la rata desde su aparición en los animales prepuberales y se mantiene a lo largo de todo el desarrollo. Los patrones morfológicos observados en las células neuroendocrinas inmunorreactivas para SER en ratas, fueron similares a los observados en humanos (9). Con respecto a la expresión de PGP 9.5, al contrario de lo que ocurre en humanos (2,35); en la próstata de la rata no se observa ninguna célula neuroendocrina que exprese esta proteína en ninguna de las regiones prostáticas. Las células neuroendocrinas que expresaban SER estaban presentes exclusivamente en los conductos excretores prostáticos periuretrales. Esto, parcialmente concuerda con lo observado por otros autores (25) que también encontraron células neuroendocrinas en los conductos y en los acinos ventrales. En este sentido, Angelsen et al. (1999), también visualizaron células neuroendocrinas entre los acinos – esta vez dorsales – pero hay que puntualizar que las ratas habían sido tratadas con testosterona (20). Esta localización predominante sobre los conductos prostáticos periuretrales, en cierto modo concuerda con lo descrito por Aümuller et al. (2001) (36) en próstata humana. Este grupo de autores indica que la mayor densidad de células neuroendocrinas se encuentra en los conductos coliculares y además tampoco encuentran células en los acinos periféricos subcapsulares. Nuestro análisis cuantitativo revela un incremento del número relativo de células neuroendocrinas inmunorreactivas para SER desde la etapa prepuberal hasta la pubertad. A continuación, el NV SER experimenta un descenso progresivo durante la madurez sexual hasta alcanzar valores semejantes a los de la etapa prepuberal en la senectud. Sin embargo, no ocurre lo mismo con el número absoluto (N) de células inmunorreactivas para SER el cual, (N SER) aparece incrementado en los adultos jóvenes. Este hecho es debido sin lugar a dudas al incremento que experimenta el volumen prostático a esta edad respecto a los volúmenes prostáticos de los animales prepuberales y puberales. Hay que resaltar que entre los volúmenes prostaticos de los animales adultos jóvenes y viejos no existe prácticamente diferencia, mientras que sí que existe diferencia en N SER entre estos dos grupos, siendo N SER significativamente superior en los adultos jóvenes que en los viejos. Cabría la posibilidad de que en el desarrollo y mantenimiento de la población de células neuroendocrinas pudieran influir los niveles de andrógenos, y de ahí estos cambios en la cantidad de células neuroendocrinas durante el desarrollo postnatal. Estos hallazgos no se adaptan a los descritos por otros autores (37), los cuales detectan un incremento en el número por unidad de área de células neuroendocrinas serotoninérgicas en la próstata de animales adultos en cobaya. Estas diferencias podrían atribuirse por un lado, a las diferentes especies, y por otro a las diferentes metodologías empleadas en la cuantificación. La evaluación del número de células por unidad de área no puede correlacionarse con el número de células por próstata lo cual si es posible con la utilización de los modernos métodos estereológicos (38). Existe un paralelismo entre la maduración de la glándula prostática y la evolución de NV en ratas, porque la actividad secretora comienza a los 12 dias del desarrollo postnatal y alcanza el máximo en la pubertad (39,40). Esto también está a favor de un efecto androgénico en el desarrollo de las células neuroendocrinas. Sin embargo, existen observaciones (34) que sugieren que el desarrollo de las células neuroendocrinas en la próstata del cobaya son independientes de la acción de los andrógenos y de la inervación. También estos resultados difieren de los descritos en próstata humana (7): la cantidad de células neuroendocrinas encontradas en los conductos periprostáticos aumenta progresivamente hasta la madurez sexual y no parecen ser andrógeno- dependientes. Por otro lado, las células neuroendocrinas encontradas en los acinos sí podrían ser andrógeno-dependientes, apareciendo en los estadios post-puberales, aumentando hasta la sexta década de la vida y a partir de ahí ya se produciría la disminución. También existen recientes estudios (36,41) acerca de la distribución y la densidad numérica de células neuroendocrinas en la próstata humana durante el periodo fetal, prepuberal y adultos jóvenes; que indican que las células neuroendocrinas aparecen a las 13 semanas de gestación tanto en los acinos como en los conductos excretores. No hay variación en la densidad numérica desde la etapa fetal hasta la etapa de los adultos, y al contrario de lo observado en ratas; no parecen existir cambios relevantes en relación con la madurez sexual. Según revela nuestro trabajo, la presencia exclusiva de estas células entre las células epiteliales columnares de los conductos prostáticos periuretrales, podría relacionar a las células neuroendocrinas con la regulación de la excreción del fluido prostático hacia la uretra. En este sentido, la serotonina podría intervenir en una estimulación de tipo hormonal para la contracción del músculo liso que rodea los conductos prostáticos de una forma similar a lo observado en la pared intestinal. Se ha demostrado que la serotonina interviene estimulando el peristaltismo intestinal; modulando la activación colinérgica e inhibiendo la activación noradrenérgica (42). En relación con este hecho, también se ha demostrado como la serotonina y los agonistas de los receptores serotoninérgicos inducen la contracción en el epidídimo y la próstata de la rata (43,44). Se han obtenido las siguientes conclusiones: a) La inmunorreactividad y distribución de células neuroendocrinas en la próstata de la rata difiere con lo descrito hasta ahora en próstata humana: no expresan PGP 9.5, y solo son inmunorreactivas para SER. Se localizan exclusivamente entre las células epiteliales columnares de los conductos prostáticos periuretrales y no aparecen entre las células epiteliales de los acinos. b) Los cambios en el número (relativo y por próstata) de células neuroendocrinas durante el desarrollo postnatal podrían estar afectados por el influjo androgénico. c) Su localización en los conductos prostáticos podría estar relacionada con la modulación de la excreción del fluido prostático hacia la uretra.
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