IV CONGRESO VIRTUAL HISPANO AMERICANO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA IV-CVHAP

CONTENIDO

 

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MÉTODO RÁPIDO PARA RETIRAR EL CUBRE DE PREPARACIONES ANTIGUAS.

Iosu Antón Badiola, Eva Peláez Boismorand, María José Freijeiro, Marta Losada, Carlos Álvarez Álvarez, José Antonio Ortiz-Rey, Pilar San Miguel Fraile, Ana De La Fuente Buceta.

Policlínico de Vigo S.A. (POVISA). Servicio de Anatomía Patológica. Vigo, Pontevedra ; y Unidad de Biología Funcional. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo, España. 

IV-CVHAP 2001 COMUNICACIÓN-E - 037

Fecha recepción: 14/02/2001
Fecha publicación: 07/03/2001
Fecha evaluación: Ver "Taller de Histología ..."

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width=5 Comentarios
 
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width=5 Resumen
width=5 Introducción
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RESUMEN
 
   INTRODUCCIÓN: En nuestro trabajo frecuentemente debemos revisar preparaciones histológicas antiguas; muchas veces tienen burbujas o se produjo decoloración de la muestra, impidiendo su estudio. Esto obliga a desmontar el cubreobjetos, proceso que a veces se prolonga hasta las 24 horas o más. Buscamos un método más rápido, que a la vez resulte seguro y eficaz. 

   MATERIAL Y MÉTODOS: Se utilizaron 500 preparaciones histológicas con una antigüedad que oscilaba entre  12 años y la actualidad, todas ellas montadas tanto con cubreobjetos cortos ( 24 mm. x 40 mm. ) como largos ( 24 mm. x 60 mm. ), excepto 20 preparaciones que se habían montado con Film de Montaje Tissue-Tek en un montador automático; en todos los casos se había usado un medio de montaje soluble en Xilol. Para desmontar los cubreojetos hemos utilizado los siguientes métodos: Inmersión en Xileno a temperatura ambiente, Inmersión en Xileno en estufa (58ºC - 60ºC ), Congelación en Nitrógeno líquido, y finalmente Congelación en seco a – 20ºC, haciendo un estudio de los tiempos mínimos en los que se lograba despegar el cubreobjetos, sin que ello comportase riesgo para la sección histológica . 

   RESULTADOS: Con Xileno a Temperatura ambiente, método tradicionalmente usado, los cubreobjetos cortos se despegaron en un período entre 12 y 24 horas, y los largos tardaron entre 24 y 60 horas. Con Xileno en estufa ( 58ºC-60ºC ), todos los cubres de desprendieron en un plazo entre 2 y 10 horas sin ninguna dificultad. Los resultados obtenidos de estas dos formas confirmaron lo que ya esperábamos por ser métodos muy conocidos y habitualmente utilizados en nuestros laboratorios. La Congelación a – 180ºC en Nitrógeno líquido permitió que en algunos casos los cubres se desprendieran al cabo de 1 hora pero ayudados de pinzas y bisturí, y con el riesgo añadido de fragmentación del cubre con lo cual se podían arrastrar pequeños fragmentos del tejido. Finalmente la Congelación a –20ºC resultó ser el método más eficaz ya que en un período de tiempo que estaba entre 30 y 45 minutos de congelación, alrededor del 90% de los cubreobjetos de las preparaciones con una antigüedad superior a dos años, se habían desprendido sin ninguna dificultad, y sin riesgo para el tejido. Los resultados fueron algo peores con las preparaciones de antigüedad entre uno y dos años ( alrededor de un 77% ), y fueron francamente malos en las preparaciones cuya antigüedad era inferior a un año ( 0% ) 

   CONCLUSIÓN: La congelación de preparaciones histológicas antiguas a –20º C, es una forma muy rápida y segura para desmontar cubreobjetos de preparaciones  con más de un año de antigüedad y sobre todo con más de dos, ya que nos permite unos resultados excelentes en un plazo de tiempo que está entre 30 y 45 minutos según nuestra experiencia.

Palabras clave: técnicas | desmontaje | preparaciones antiguas | burbujas | decoloración
     

 

INTRODUCCIÓN
   
   En nuestro trabajo rutinario frecuentemente tenemos que recurrir a revisar preparaciones histológicas antiguas, y nos encontramos con el problema de las burbujas de aire y/o la decoloración de la muestra. Esto nos obliga a desmontar el cubre, no sin dificultad en muchas ocasiones, y no es raro que este proceso se demore por 24 horas o más. Tratando de buscar un método más rápido, buscamos en la bibliografía al respecto, que es muy escasa, y encontramos un método que consiste en congelar la preparación a –20º C (1) intentando verificar los resultados.
   

 

MATERIAL Y MÉTODOS
 
   Se utilizaron 500 preparaciones histológicas de nuestro archivo, tomadas al azar, con una antigüedad que oscilaba  entre 12 años y la actualidad. Todas ellas, excepto 20 preparaciones, habían sido montadas con cubreobjetos de cristal, tanto cortos ( 24 mm. x 40 mm. ) como largos ( 24 mm. x 60 mm. ); los 20 casos restantes, que eventualmente tenían un antigüedad de 4 años, habían sido montados con Film de Montaje Tissue-Tek en un montador automático. Siempre se había usado un medio de montaje soluble en Xilol. Para desmontar los cubreojetos hemos utilizado los siguientes métodos: Inmersión en Xileno a temperatura ambiente ( 30 preparaciones con cubreobjetos de cristal con una antigüedad entre 12 años y la actualidad ), Inmersión en Xileno en estufa a una temperatura entre 58º C y 60º C ( 30 preparaciones con cubreobjetos de cristal con una antigüedad entre 12 años y la actualidad ), Congelación en Nitrógeno líquido a – 180º C ( 20 preparaciones con cubreobjetos de cristal con una antigüedad entre 12 años y la actualidad ), y finalmente Congelación a – 20º C ( 420 preparaciones, de las que 400 tenían cubreobjetos de cristal con una antigüedad entre 12 años y la actualidad, mientras que los 20 casos restantes tenían como cubreobjetos Film de montaje y una antigüedad de 4 años ).
   

RESULTADOS


   Con inmersión de la preparación en Xileno a Temperatura ambiente, método tradicionalmente recomendado y usado, se consigue que los cubreobjetos cortos se despeguen en un período entre 12 y 24 horas, mientras que para los largos se necesita entre 24 y 60 horas. En muchos casos hubo que ayudarse de una hoja de bisturí,  sin que esto supusiera ningún riesgo para el tejido; los cubreobjetos salieron enteros, sin fragmentación. Dejándolos hasta 4 días los cubres se despegan sin ninguna dificultad, sin necesidad de la ayuda mecánica de la hoja del bisturí o las puntas de una pinza.
   Con inmersión de la preparación en Xileno en estufa ( 58º C-60º C ), se acelera el proceso ya que los cubreobjetos  se habían despegado en un período entre 2 y 10 horas, no necesitando en ningún caso la ayuda de la hoja de bisturí. 
   La Congelación de las preparaciones a – 180º C en Nitrógeno líquido ofrece resultados muy irregulares, ya que en algunos casos los cubreobjetos se podían desprender al cabo de 1 hora pero ayudados de pinzas y bisturí, y con el riesgo añadido de fragmentación del cubre con lo cual se podían arrastrar pequeños fragmentos del tejido. Una permanencia más duradera de las preparaciones en Nitrógeno Líquido no permitió mejorar los resultados. En consecuencia este método no nos pareció recomendable y lo desechamos.
   Finalmente la Congelación de la preparación a –20º C resultó ser el método más eficaz. 
  • Los resultados más sorprendentes se produjeron con las preparaciones montadas con Film de Montaje por el montador automático, que tenían una antigüedad de 4 años; en 30 minutos el cubreobjetos de las 20 preparaciones utilizadas se encontraba completamente desprendido, pero con la peculiaridad de que la sección histológica había quedado adherida a los mismos, en lugar de quedar adherida al portaobjetos, tal y como hubiésemos esperado. Solo en dos casos fue necesario ayudarse de la punta de un bisturí para iniciar el despegamiento en una de las esquinas de la preparación; una vez iniciado este despegamiento saltaba el cubreobjetos completo.
  • Los resultados con los cubreobjetos de cristal fueron así mismo satisfactorios, aunque dependiendo de la antigüedad los resultados fueron dispares, llegándose a los mismos en un período de tiempo que iba desde los 30 hasta los 60 minutos de congelación. 
  • Sin embargo el primer ensayo con cubreobjetos de cristal lo hicimos con las 80 preparaciones que tenían menos de un año de antigüedad, y no conseguimos éxito completo en ninguno de ellos: En 72 casos ( 90% ) la retirada del cubreobjetos fue absolutamente imposible, y solo en 8 ( 10% ) se llegó a desprender parcialmente con fragmentación y riesgo para la sección histológica por lo que desistimos de seguir intentándolo.
  • A continuación se utilizaron las 90 preparaciones de antigüedad entre 1 y 2 años. En 65 preparaciones ( 72,2% ) el cubreobjetos se desprendió entero sin ninguna dificultad, en 4 ( 4,4% ) se produjo fragmentación en 2 o 3 fragmentos sin ningún riesgo para el tejido;  en 7 casos  ( 7,8% ) hubo mayor fragmentación con mínima afectación del tejido, y finalmente en 14 casos ( 15,6% ) resultó imposible despegar el cubreobjetos. 
  •  De las 230 preparaciones de antigüedad entre 3 y 12 años, que tenían cubreobjetos de cristal, y  que se congelaron a -20ºC entre 30 y 60 minutos, obtuvimos los resultados más convincentes ( ver tabla ). En 205 casos ( 89,1% ) el cubreobjetos se desprendió entero y sin daño para la sección; en 3 preparaciones   ( 1,3% ) se produjo fragmentación en 2 o 3 fragmentos grandes sin riesgo para el tejido; en 7 casos ( 3,1% ) se produjo mayor fragmentación con riesgo para la sección de tejido llegando a producirse un mínimo arrastre del mismo; finalmente hubo 15 preparaciones ( 6,5% ) en las que resultó totalmente  imposible despegar el cubreobjetos.
   PROCEDIMIENTO: Siempre comenzamos el intento de despegamiento eficaz a los 30 minutos de congelación  (en algunos casos comenzamos a los 20 y 25 minutos pero nuestra experiencia recomienda empezar a los 30 minutos).En todos los casos se utilizó una hoja de bisturí, que se iba reponiendo a medida que observábamos que iba perdiendo eficacia debido al medio de montaje que iba quedando adherido al filo de la misma; hay que tener la precaución de retirar con anterioridad la etiqueta identificativa de la preparación. Posteriormente se puede usar la hoja de bisturí al menos en las  dos maneras en las que nosotros lo hemos intentado con los resultados antes expuestos:1) En primer lugar se introduce la punta del bisturí en una de las esquinas de la preparación hasta que esta se despega, y posteriormente se continua despegando toda la periferia del cubreobjetos. Después, introducimos la hoja prácticamente completa entre el cubreobjetos y la sección histológica, y con un suave movimiento de vaivén, siempre manteniendo el paralelismo entre la hoja y el cubreobjetos,vamos avanzando hasta el final. Nosotros preferimos la segunda manera, 2) que consiste en despegar totalmente uno de los lados cortos del cubreobjetos y a partir de ahí continuar con el movimiento de vaivén,   hasta llegar al otro extremo, con la hoja de bisturí introducida prácticamente en toda su longitud, hasta donde nos lo permita el tope del mango del bisturí. En cualquier caso hay que proceder con mucha precaución, paciencia y suavidad, evitando los movimientos bruscos. Es muy importante mantener la hoja de bisturí lo más paralela posible al cubreobjetos, sin darle ángulo ya que la más ligera inclinación puede comenzar la fragmentación del cristal. Por otro lado es frecuente escuchar un leve crujido al paso del filo de la hoja. Sin que esto se traduzca en riesgo absoluto de fractura, al menos en nuestra experiencia, sí nos recuerda que debemos proceder con sumo cuidado. 

  Finalmente queremos señalar que los mejores resultados se obtuvieron entr 30 y 45 minutos de congelación; pasados los 60 primeros minutos  los resultados no mejoran ostensiblemente, y pasadas las dos horas los resultados tienden claramente a empeorar. Esto lo hemos comprobado con aquellas preparaciones en las que no pudimos liberar el cubreobjetos, siendo también el caso de aquellas preparaciones en las que se produjo fragmentación de trozos pequeños con arrastre de tejido. Por todo ello creemos que si no hemos obtenido éxito en los primeros 60 minutos, probablemente lo mejor es desistir del intento y recurrir a los métodos tradicionales.

ANTIGÜEDAD Nº  CASOS CUBRE ENTERO MÍNIMA FRAGMENTACIÓN TEJIDO SIN AFECTACIÓN FRAGMENTACIÓN TEJIDO CON AFECTACIÓN IMPOSIBLE
3 - 12 AÑOS 230 205
( 89,1 % )
3 ( 1,3% ) 7 ( 3,1% ) 15 ( 6,5% )
1 - 2 AÑOS 90 65
( 72,2% )
4 ( 4,4% ) 7 ( 7,8% ) 14  ( 15,6% )
MENOS DE 
 1 AÑO
80 0 ( 0% ) 0 ( 0% ) 8 ( 10% ) 72 ( 90% )


   

CONCLUSIONES
 
   La congelación de preparaciones histológicas antiguas a –20º C ha demostrado, en nuestra experiencia, ser una forma rápida y eficaz para desmontar cubreobjetos de preparaciones  de más de 1 año y sobre todo de más de 2 años de antigüedad, ya que nos permite unos resultados excelentes en un plazo de tiempo de entre 30 y 45 minutos de congelación.
   

 

NOTAS AL PIE DE PÁGINA
 
   Correspondencia: Iosu Antón Badiola. Policlínico de Vigo S.A. (POVISA). Servicio de Anatomía Patológica. Vigo, Pontevedra, España. mailto:iamaaa@teleline.es
   

REFERENCIAS
 


   1. Ellis R.C.. Laboratory Histopathology. A complete reference. Vol. 1. Chapt. 4 ( 4.6-5 ). Woods A.E., Churchill Livingstone, New York. 1994.