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Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia (FISH).

Dra María Isabel Perez Robalino , Dr Jorge Ugalde Puyol y Dr Hernán Neira Maldonado

Departamento de Patología
Instituto del Cancer. Solca.
A. Cueva S/N Cuenca
01011720 Azuay

Ecuador
 Introducción
El cáncer cérvico uterino a pesar de ser una enfermedad prevenible, sigue siendo una de las más frecuentes causas de mortalidad en mujeres de Latinoamérica y otras partes del mundo. La mayoría de mujeres que desarrollan cáncer cervical se encuentran en su cuarta o quinta década de la vida(1).
En nuestro medio el cáncer cérvico uterino tiene una incidencia de 19.8 x 100.000 habitantes y es la segunda causa de muerte luego del cáncer gástrico. (2); se observa en clase social y económica baja, de nivel cultural bajo, que no acude por diferentes motivos a servicios de prevención de cáncer existentes en el País.
Uno de los factores estudiados en las últimas décadas es papiloma virus humano(HPV), como agente precursor de lesión genética del epitelio genital, causante de neoplasia que es diagnosticada en fases avanzadas del padecimiento.
La declaración de Consenso sobre Cáncer de Cérvix del Natitonal Institute of Health establece que este cáncer está relacionado de forma causal con la infección por el virus del papiloma humano (3). Desde entonces numerosos estudios epidemiológicos y moleculares han demostrado que la infección por HPV es precursora en el 95% de los cánceres cervicales.(3)
Existen más de 80 tipos de este virus, de los cuales unos 25 afectan el tracto genital. Los subtipos de HPV se clasifican en categorías de riesgo (bajo, intermedio y alto) sobre la base de su relación con lesiones de alto grado e invasoras.(4,5).
Virtualmente en todos los cánceres cervicales y en sus lesiones precursoras se encuentra ADN de HPV.
La citología demuestra lesiones citopáticas del epitelio, la colposcopía visualiza la lesión y la biopsia diagnóstica, considerándola como “estándar de oro” en la valoración de la patología neoplásica cervical.
La biología molecular nos permite valorar los cambios genéticos en las células neoplásicas, demostrar secuencias moleculares que han determinado los cambios de comportamiento celular, así como investigar y demostrar la presencia de secuencias virales como agentes de inducción neoplásica.
En los últimos años se han desarrollados técnicas moleculares que demuestran de diferente manera secuencias de DNA o RNA que nos interesa demostrar, con diferente grado de sensibilidad, una de ellas, práctica en el trabajo en anatomía patológica es la Hibridación in Situ mediante cromógenos y fluorescencia, que nos permite ver sobre el tejido la presencia de virus o secuencias buscadas para una correlación con los hallazgos patológicos.
El método de Hibridación in situ por fluorescencia (FISH) se basa en la detección y localización de secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células o tejidos(6); esta técnica consiste en colocar la sonda directamente sobre el espécimen (material genético como cromosomas, citologías, secciones histológicas embebidas en parafina) que tiene la secuencia del DNA inmovilizada; el tejido es tratado con una enzima que permite el acceso de la sonda al DNA nuclear, el que ha sido previamente desnaturalizado por calor.(7) La sonda se agrega para la hibridación y ésta ocurre si está presente el DNA blanco complementario de la sonda. La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es observada mediante microscopía de fluorescencia (6,7).
 Material y Métodos
Se incluyen en el estudio 77 pacientes con lesiones preinvasivas de bajo, alto grado y carcinoma invasor diagnosticadas en el Instituto del Cáncer; Solca-Cuenca en el período de agosto 2000 hasta agosto del 2003.
El estudio se realizó en tejidos incluidos en parafina, utilizando sondas marcadas con fluoresceína, para virus de bajo riesgo (6/11), riesgo intermedio (31,33)y riesgo alto (16/18).(InmunogenexR)

TECNICA:

1. Corte y desparafinado del tejido.
2. Lavado de slides con bloqueador de RNAsas
3. Tratamiento del tejido con proteinasa K,.
4. Colocación de la sonda sobre el tejido para hibridizar en cámara húmeda a 85-90°C durante 10 minutos y dejar a 37°C toda la noche tiempo en el que se realiza la hibridación.
5. La unión de la sonda es detectada por:
- Adición del anticuerpo antibiotina antifluorescenína.
- El anticuerpo secundario biotinizado.
- El conjugado fosfatasa alcalina streptoavidina.
6. Medio de contraste fast red.
7. Proceso de deshidratación y montaje de los slides.
(InmunogenexR )



Para la interpretación se utilizó un microscopio Zeiss Axio Plan 2 con epifluorescencia Cámara digital Sony. La positividad está dada por la reacción de hibridación con la sonda que marca en el interior del núcleo de las células epiteliales. El cuerpo viral fluorescente corresponde al virus del HPV siendo valorado en cruces: + (aislado), ++ (10-30 campo), +++ (> 30 campo). (Fig 1 y 2).
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Biopsia de cuello uterino, técnica de FISH positiva para HPV 16-18
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Biopsia de Cuello uterino, técnica de FISH negativo para HPV 16-18
 Resultados
El grupo de estudio esta conformado por pacientes con un rango de edad de 18 años a 65 años, los grupos más numerosos están entre los 20 a 29 y 30 a 39 años; con lesiones epiteliales de bajo e intermedio grado, más frecuente que corresponde al 68%; los casos de alto grado representaron el 31 % de la serie. Los casos de carcinoma invasor se presentan en el grupo de mujeres sobre los 50 años con 15.5%.(cuadro 1)
El estudio por hibridación mostró una positividad en toda la serie de 62 casos para una de las sondas virales de investigación, representando 80.5 %; los casos negativos se presentaron al azar, en los diferentes grupos de pacientes con lesión neoplásica preinvasiva e invasiva.(cuadro 2)
En relación a los grupos virales de bajo grado, alto e intermedio, existe una frecuencia mayor del grupo de alto grado (50 %), seguidos por el grupos de bajo riesgo (6-11), con el 37 %, mientras que el grupo de riesgo intermedio representa el 12.9 % (cuadro 3).
El inicio de la vida sexual valorada en tres grupos de edad, muestra una frecuencia del 61.12 % entre los 16 y 20 años, con frecuencias importantes para el grupo de mujeres adolescentes (cuadro 4)
La variable de número de compañeros sexuales mostró una frecuencia marcada en el grupo de un compañero, observándose una importante frecuencia del grupo de dos compañeros (cuadro 5).
Los estudios colposcópicos mostraron varios tipos de lesiones, la correlación con los hallazgos anatomopatológicos es del 84.61% (gráfico 6).
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
DIAGONOSTICO MOLECULAR DEL VIRUS DEL HPV POR FISH, DISTRIBUCION SEGÚN EDAD Y TIPO DE LESION
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Diagnóstico molecular de HPV por FISH.
Distribución por tipo de lesión y HPV.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Diagnóstico molecular de HPV por FISH.
Lesión histológica y variedad viral.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Diagnóstico molecular de HPV por FISH.
Inicio de vida Sexual
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Disagnóstico molecular de HPV por FISH.
Concordancia colpohistológica.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Diagnóstico molecular de HPV por FISH.
Frecuencia de lesiones colposcópicas.
 Discusión
El cáncer cervical es una de las primeras neoplasias humanas de mayor incidencia en la cual se ha identificado un factor etilológico único. Los resultados de asociación entre el HPV y la neoplasia varían en los diferentes estudios, al parecer según el método utilizado para la detección del virus, con una muy buena sensibilidad mediante las técnicas moleculares de FISH y PCR.
La lesión precancerosa se observa de 10 a 20 años, antes de aparecer las lesiones histológicas invasivas, por lo que los estudios citológicos y moleculares constituyen un método de diagnóstico y prevención de carcinoma cervico-uterino. (9)
La más alta prevalencia de infección por HPV se han hallado en mujeres menores de 29 años, las de mayor edad (40-50 años); tienen menor riesgo de contraer infección por el virus, posiblemente debido a inmunidad adquirida al HPV por exposiciones pasadas.
La incidencia del cáncer invasivo aumenta considerablemente con la edad, con un pico máximo entre los 45 y 60 años (8), en el presente estudio, las 12 pacientes con cáncer invasivo tuvieron mas de 50 años.
Bossch et al, en su estudio determinan la prevalencia del ADN de HPV en tumores invasores en 1.060 biopsia de casos de carcinoma invasivo en 22 países, con una frecuencia del 89 al 93% (10)

Actualmente la infección por el HPV se considera el principal factor de riesgo para el cáncer de cervix, lo que debe hacer reinterpretar el papel de los factores clásicos que podrían actuar de forma independiente o podrían ser cofactores de la infección por HPV en la carcinogénesis.

La importancia del inicio de la vida sexual, mostró en nuestra serie que, el 61% de las pacientes iniciaron su vidad sexual activa entre los 16 y 20 años (fig: ); el 71% de las paciente han tenido un compañero sexual. (fig: )

De las 77 pacientes 52 se realizaron colposcopía , siendo las imagénes patológicas mas frecuentemente encontradas: leucoplasia en el 42.3%, Mosaico en el 9.61%, No imágenes colposcópicas patológicas el 9.61%, Puntillado el 7.69%, Condiloma el 7.69%. La concordacia establecida entre los hallazgos colposcópicos y patológicos, fue del 84.61%.

La progresión a cáncer de cervix viene determinado por la infección persistente por el HPV. No obstante un alto porcentaje de estas infecciones regresa espontáneamente y otro, entre el 5 y 10%, adquiere el estado de portadora crónica, alguna de las cuales evoluciona posteriormente a lesiones neoplásicas.
Hasta la fecha no hay forma alguna de predecir que paciente se mantendrá dentro de la misma categoría de NIC, cual progresará a alguna forma mas grave de NIC o cáncer invasor y cuanto tardará en ocurrir dicha transición.(11)

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) permite la detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucléicos dentro de las células o tejidos, con un alto grado de sensibilidad y especificidad.
El HPV 6/11 está asociado con lesiones benignas o de bajo riesgo, como el condiloma genital y NIC menores.(11); mientras que el HPV 16 /18 se relaciona con un grupo de alto riesgo oncogénico, como el cáncer cervical, y las formas de NIC mas significativas (11); y los asociados con lesiones escamosas intraepiteliales y carcinomas invasivos, divididos a su vez en un grupo de riesgo intermedio, como el tipo 31/33.(11)


En el estudio realizado de los 27 pacientes diagnosticadas NIC I la mayor positividad para el HPV es para el tipo viral 6/11 con el 44.44% . De los 25 pacientes diagnosticados de NIC II su mayor positividad es para el tipo viral 16/18 con el 48%.
De las 13 pacientes con NIC III el 77% fue positivo para el tipo 16/18 de alto riesgo, la misma cepa 16/18 se encontró en el 42% de los carcinomas.

La utilización de técnicas moleculares como la Hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para la tipificacion HPV, es una procedimiento práctico y factible con un alto grado de sensibilidad y especificidad, permite establecer la correlación entre el tipo de lesión anatómica y la presencia del genoma viral en el interior del epitelio y de las células, establecer su variedad de los tipos que tienen importancia como oncogénicos en el aparato genital femenino.

La literatura con experiencia mediante esta técnica no es abundante, nuestra observación nos permite recomendar para los casos de estudios directos sobre tejidos procesados en parafina, poder determinar la presencia y variedad viral, correlacionando con la clínica con el fin de dar un tratamiento adecuado a cada uno de los casos.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Imagen en mosaico y relación histológica.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Lesion en condiloma y representación histológica.
Imagen de Diagnóstico molecular del virus del papiloma humano por hibridación in situ por fluorescencia  (FISH).Zoom
Patrón de leucoplasia e imagen histológica.
 Bibliografia
1. Robbins. Patología Funcional y Estructural. Aparato Genital Femenino. 1995;5:1093-1098.
2. Registro de Tumores SOLCA-Cuenca. Tercer Informe 1996-2000.
3. Patricia J.Eifel, Charles Levenback.Atlas de Oncología. Cancer del Tracto Genital Femenino.2000;1-9
4. med.javeriana.edu.co/publi/universitas/2000/virus.PDF
5. Morrison EAB , Hogyf, Vermumnd SH. Human papilomavirus infection and otrher risk factor for cervical neoplasia. Int J Cáncer 1991; 6-13.
6. Julia M. Polar and James O´D.McGee . In Situ Hibridization, Principles and Practice. Medicine Neurochemestry .1991; 9: 125-139.
7. Ronald A. Delelles. MD. In Situ Hibridization Techniques for the Análisis of gene Expresión: Applications in Tumor Pathology. Human Pathology.1999;25: 580-590.
8. Papanicolau Smear. Clinicians Hand Book of Preventive Services ..II Ed.Washinton: Us Govermment Printing, Office Junio/2000.
9. Revista del Instituto Nacional de Cancerología México.1999;45.206-207.
10. Bossch Fx. El virus del Papiloma Humano y los del Tracto Genital Femenino. Oncología 1996 ;157-164.
11. Creasman. Oncología Ginecológica Clínica Disaia. 1999; 5:11-12

 Comentarios

El 7/3/2004 1:01, Dra. Margarita Amigó dijo:

El trabajo esta muy interesante,y demostrativo.

Gracias por enviarlo.

El 12/3/2004 12:46, Mirta Garcia Jardón dijo:

Felicidades por su trabajo tan interesante. Voy a utilizar palabras textuales del colega Emilio Mayayo para decirles que "son trabajos como este de ustedes, los que elevan la importancia y calidad de nuestro congreso. Un saludo.

El 16/3/2004 19:40, Victor Leonel Argueta, Guatemala dijo:

Estimados colegas: El trabajo es muy bueno. Felicidades.

Me llama la atención la alta correlación que existe con el estudio de colposcopïa y el estudio histológico.

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