Cuba

OBJETIVOS
Determinar la frecuencia de la displasia epitelial en la leucoplasia bucal y clasificarla según su grado de severidad, así como confirmar que la oncoproteína p53 exhibe un aumento progresivo desde los distintos grados de severidad de la displasia epitelial hasta el carcinoma epidermoide bucal.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se estudió la frecuencia y severidad de la displasia epitelial y su asociación con las variables clínico-histipatológicas, y se evaluó la expresión de la oncoproteína p53. Para ello se estudiaron los datos y las biopsias de 83 pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal, procedentes de la facultad de Estomatología del ISCM-H. Se realizó técnica de H/E e inmunohistoquímica mediante el método de avidina-biotina peroxidasa complejo.
RESULTADOS
Se observó una mayor frecuencia de displasia epitelial en hombres, de la raza blanca, de 40 a 59 años. Las localizaciones más frecuentes fueron las mucosas del carrillo, lengua y la encía. El grado de severidad de la displasia epitelial se asoció significativamente con el patrón de queratinización, la intensidad del infiltrado inflamatorio y el nivel de expresión de la p53, pero no con las variables clínicas, ni con el grosor epitelial. Nuestros resultados sugieren que los factores de riesgo (tabaco, alcohol e infecciones virales) son los que influyen directamente en el desarrollo de esta lesión premaligna.
CONCLUSIONES
Se encontró una elevada frecuencia de biopsias con displasia epitelial ligera en la muestra estudiada evidenciándose la utilidad del análisis inmunohistoquímico de la oncoproteína p53, por lo que recomendamos realizar estudios similares donde se incluyan estos factores para una mejor comprensión del proceso carcinogénico de la displasia epitelial en la leucoplasia bucal.

La leucoplasia bucal, es una lesión predominantemente blanca de la mucosa bucal, que no desaparece al frotarla, no puede ser caracterizada como alguna otra lesión definida y que dependiendo de las circunstancias del examen será posible llegar a un diagnóstico provisional o definitivo (1, 2).
El Centro Internacional de Precáncer Bucal, desde el punto de vista clínico subdivide a las leucoplasias en homogéneas Fig_1 y no homogéneas Fig_2 . Esta clasificación tiene implicaciones importantes puesto que algunos tipos poseen un mayor riesgo significativo de cambios malignos subsecuentes. Generalmente se acuerda que las leucoplasias homogéneas tienen un bajo riesgo de transformación maligna, mientras que las formas no homogéneas muestran todo lo contrario (1 – 4).
En el análisis microscópico, se pueden observar diferentes tipos de alteraciones hísticas relacionadas con esta lesión precancerosa, como son: desarrollo de un proceso de queratinización, cambios en el grosor epitelial, ulceraciones en el epitelio de la mucosa y presencia de displasia epitelial, así como cambios celulares en el tejido conjuntivo subyacente (1, 3, 5). Hay evidencias de que entre todas estas observaciones, la displasia epitelial, es el predictor histológico de cambios malignos que guarda una mayor relación con el carcinoma epidermoide (1, 3, 4 – 7, 9, 10), sin embargo existen todavía problemas sin solución acerca del diagnóstico objetivo de este tipo de alteración, puesto que las técnicas que se utilizan dependen mucho de la subjetividad con que el histólogo y/o patólogo observan las biopsias (11 – 13).
El término displasia, significa literalmente crecimiento desordenado, debido a trastornos en el crecimiento normal, proliferación, maduración y organización de las células. Cerca de un 25% de las lesiones leucoplásicas, muestran evidencias de displasia epitelial o carcinoma in situ en el primer reconocimiento histopatológico (6).
Sin embargo, debido a la variabilidad de los rasgos celulares presentes y a los conceptos establecidos para identificar los diferentes grados de severidad de la displasia epitelial, la determinación final es esencialmente subjetiva, razón por la cual desde la década del 80 se empezaron a buscar predictores específicos en estudios histoquímicos, morfométricos, y ultraestructurales y más recientemente en el campo de la biología molecular, con el objetivo de proveer indicadores pronósticos de mayor certeza.
El gen p53, es el blanco más frecuente de las alteraciones genéticas en el cáncer humano (14 – 19). La p53, es un factor de transcripción nuclear, cuya principal función es monitorear la integridad y estabilidad del genoma y en algunos casos actuar específicamente como supresora de la angiogénesis. Estas funciones las logra uniéndose específicamente y regulando la expresión de una amplia variedad de genes involucrados en la detención del ciclo celular y la apoptosis (20).
La sobrexpresión del gen p53, se ha observado con una elevada frecuencia en el carcinoma epidermoide bucal (43% a 93%), más que en ningún otro tumor maligno humano (12). Además se ha observado que en las lesiones premalignas bucales y en los carcinomas in situ, la sobrexpresión de p53 no está restringida sólo a las células neoplásicas, sino que frecuentemente aparece en áreas displásicas o en queratinocitos adyacentes a células neoplásicas positivas al p53, por lo que se infiere que esta alteración es un evento que ocurre tempranamente en el proceso de carcinogénesis bucal (21). Observándose una correlación entre el aumento en la proporción de las células inmunorreactivas y el grado de severidad de la displasia epitelial, que llega a ser hasta de un 60 a un 67% en las displasias ligeras y moderadas y de un 85% en las severas (22).
Por lo que sugieren que la expresión de la oncoproteína p53 puede ser una herramienta útil para el diagnóstico y pronóstico de las lesiones potencialmente malignas, como es el caso de la leucoplasia bucal (22).

Se realizó un estudio retrospectivo y descriptivo que comprendió los siguientes aspectos:
1. Estudio clínico-histopatológico
2. Estudio inmunohistoquímico.
1. Estudio clínico-histopatológico
Se analizaron 83 pacientes con diagnóstico clínico e histopatológico de leucoplasia bucal, atendidos en las consultas de Patología Bucal y Cirugía Maxilofacial de la Facultad de Estomatología del Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana.
A partir de las órdenes de biopsias de los pacientes, se realizó un análisis retrospectivo, en el período comprendido entre los años 1991 y 2002, de los siguientes datos: edad, sexo, color de la piel y localización de la lesión.
Las muestras fueron tomadas bajo anestesia local con Lidocaína al 2%, obteniéndose un fragmento de tejido de mucosa bucal lesionada, mediante la utilización de bisturí o ponchador. Esta muestra fue útil tanto para el diagnóstico histopatológico de la lesión como para el análisis inmunohistoquímico.
Las muestras fueron fijadas en formalina neutra al 10% y procesadas mediante la técnica de inclusión en parafina. Se realizaron cortes de 7µm de grosor en un micrótomo vertical Spencer y se utilizó la coloración de Hematoxilina y Eosina (23).
En cada corte se estudiaron de uno a tres campos, que presentaban focos de displasia epitelial, desechando siempre los bordes de la muestra y en los que se analizaron las siguientes alteraciones histopatológicas:
1 Displasia epitelial.
2 Tipo de queratinización.
3 Grosor epitelial.
4 Alteraciones en el tejido conjuntivo.
Para las observaciones se utilizaron magnificaciones de 100X, 400X y 1000X, en un microscopio Karl Zeiss.
Estudio inmunohistoquímico
Se seleccionaron 46 biopsias de las 83 analizadas en el estudio histopatológico, que tenían en su diagnóstico signos de displasia epitelial, 20 de pacientes con diagnóstico de carcinoma epidermoide de cavidad bucal, procedentes del Departamento de Patología Bucal de la Facultad de Estomatología del Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana y 5 de mucosa bucal aparentemente normal, de pacientes atendidos en el Departamento de Cirugía Maxilofacial del Hospital Enrique Cabrera.
Las muestras de mucosa aparentemente normal y de carcinoma epidermoide fueron fijadas y procesadas de igual manera que las biopsias de leucoplasia bucal, el primer corte de cada bloque se coloreó con la técnica de Hematoxilina y Eosina (23).
Para la técnica de inmunohistoquímica se tomaron dos cortes seriados de 3-5 µm/lámina, éstos se colocaron uno en cada extremo de la lámina portaobjetos pretratada con gelatina cromalum y se les realizó el proceso de desparafinado e inhibición de la peroxidasa endógena.
Para la inmunocoloración de los núcleos positivos al AcM p53, se utilizó el método de la Avidina-Biotina Peroxidasa Complejo.
Como control positivo, se empleó una muestra de Carcinoma Epidermoide de pulmón que sobrexpresaba este antígeno, incubada con el AcM primario o con isotipo control IgG 2b (Pharmigen).
Se utilizaron como controles negativos uno de los cortes incubados con TBS en lugar del AcM primario.
Todas las diluciones se realizaron con PBS/BSA/Azida excepto la del ABC/HRP que se realizó con TBS.
La reacción positiva consiste en un precipitado de color pardo-café para el DAB en la zona de reacción del Ag-Ac.
Se observaron 10 campos por lámina en un microscopio óptico Karl Zeiss, se hicieron los recorridos con aumento 2000X.
A partir de esto la reacción del AcM fue valorada cuantitativamente, teniendo en cuenta que los núcleos positivos fueron los que se colorearon de marrón.
Para determinar la proporción de células positivas, se contaron en cada uno de los campos la cantidad de núcleos positivos y negativos, y se determinó el porcentaje de células positivas.
Se calculó la media del porcentaje de células marcadas positivamente y se utilizó el siguiente punto de corte, tomando en cuenta los reportados en la literatura (22, 24 – 27).
Positiva: p53 > 50% de células positivas.
Negativa: p53< 50% de células positivas.
Se digitalizaron las imágenes en un Microscopio Leyca, acoplado a la computadora programada con el sistema Atiplay.

Estudio clínico – histopatológico
De los 83 pacientes con diagnóstico clínico de leucoplasia bucal, se encontró que 77 de los mismos tuvieron displasia epitelial para un 92,8%.
De acuerdo al grado de severidad de la displasia epitelial, se observó en más del 50% de los casos displasia epitelial ligera [Fig_#3], seguida en orden descendente por la displasia epitelial moderada [Fig_#4] y la severa [Fig_#5].

Displasia epitelial y parámetros clínicos
Edad
La edad promedio fue de 49.7, la edad mínima establecida fue de 18 años y la máxima de 85. La mayor frecuencia de displasia epitelial se observó entre la 5ta y la 6ta década de la vida. No hubo diferencias significativas entre la displasia ligera, moderada y severa y los diferentes grupos de edades. (χ2 1.00, gl 4, p>0.05)

Sexo
A pesar de que hubo un predominio del sexo masculino (58,4%), con relación al femenino (41,6%), no se encontraron diferencias significativas entre hombres y mujeres y los diferentes grados de la displasia epitelial. (χ2 3.501, gl 2, p>0.05)

Color de la piel
De los pacientes estudiados el 80% fueron de piel blanca, y el 19,5% mestizos y negros. Al realizar el análisis estadístico, no se encontraron diferencias significativas entre el color de la piel y los diferentes grados de la displasia epitelial (χ2 8.360, gl 4, p>0.05).

Localización de la lesión
El mayor número de lesiones se localizó en la mucosa del carrillo (58,8%), la lengua (22,1%) y la encía (19,1%).
Otras localizaciones tuvieron un 11,7%.

Displasia epitelial y parámetros histopatológicos
Tipo de queratinización
Del total de los casos examinados, el 60,3% presentó paraqueratosis, el 23,4% ortoqueratosis y el 14,3% correspondió a muestras donde se combinaron los dos tipos de queratinización.
Al realizar el análisis estadístico, se encontró asociación significativa entre los tres tipos de queratinización y el aumento progresivo en severidad de la displasia epitelial. Fig_6

Grosor epitelial
La hiperplasia epitelial, fue la alteración que se observó con mayor frecuencia con un 57,1%, y la atrofia epitelial, la menos frecuente con un 3,9%. En el resto de las muestras, el grosor epitelial fue de aspecto normal.
No se encontraron diferencias significativas entre el grado de displasia epitelial y el grosor epitelial. (χ2 1.558, gl 4, p>0.05).

Infiltrado inflamatorio
La presencia de infiltrado inflamatorio, a expensas de linfocitos, se mostró en mayor o menor grado en el 79,2% de las muestras examinadas.
Se observó que el grado de infiltrado inflamatorio fue aumentando de manera significativa a medida que se incrementó el grado de severidad de la displasia epitelial, específicamente de ligera a moderada (p 0.00012) y de ligera a severa (p 0.00000), no siendo así al pasar de moderada a severa. Fig_7

Estudio inmunohistoquímico
En los casos de displasia epitelial, se encontró que el grado de expresión de la oncoproteína p53, aumentó significativamente con respecto al grado de severidad de la displasia epitelial. (χ2 9.36667, gl 2, p<0.05).
Los núcleos positivos en las lesiones displásicas se asociaron generalmente con las células que mostraron atipia celular, Fig_8, Fig_9, Fig_10 Nótese que en la displasia ligera, la positividad de los núcleos estuvo confinada sólo a los estratos basal y parabasal, mientras que en la displasia severa la distribución de los núcleos teñidos positivamente fue mucho más amplio, observándose hasta en los estratos superiores.

Leucoplasia bucal y displasia epitelial
La alta proporción (92,8%) de muestras con displasia epitelial encontrada, no coincide con lo reportado por la mayoría de los autores, quienes refieren cifras mucho menores que oscilan entre el 20 al 50% (1 – 4, 9, 11, 12).
Es bien conocido que el porcentaje de lesiones leucoplásicas con displasia epitelial, varía según el tamaño muestral y los criterios de los diferentes autores (1, 3, 5, 11, 12). En nuestro caso, la elevada incidencia de esta alteración histopatológica podría estar relacionada con los criterios utilizados para la toma de la muestra en las consultas de patología bucal (7, 9), ya que en nuestro país sólo son biopsiables aquellos pacientes clínicamente comprometidos, es decir, pacientes con leucoplasias no homogéneas, que se caracterizan por presentar una elevada asociación con la displasia epitelial y por tanto mayor probabilidad de sufrir malignización (1 – 4).
Sin embargo, en la mayoría de los países, el criterio utilizado para la toma de la muestra es diferente, pues no depende de la apariencia clínica de la leucoplasia, por lo que son biopsiados todos aquellos pacientes que después de cuatro semanas de eliminado el factor de riesgo, se mantiene la lesión 9 aún cuando se trate de una leucoplasia homogénea, forma clínica que se caracteriza por presentar un bajo porciento de asociación con la displasia epitelial (1 – 4).
Grados histológicos de displasia epitelial
La mayor frecuencia de displasia epitelial ligera y la menor de displasia moderada y severa, observada en nuestra serie, concuerda con lo reportado por la mayoría de los investigadores (1 - 3, 5, 7, 9, 12, 28, 29).
Los diferentes grados de displasia epitelial se traducen en alteraciones en el patrón de proliferación, diferenciación y maduración celular, y aumentan progresivamente en el tiempo, a medida que se establece un proceso de carcinogénesis epitelial (6). Los carcinomas que se desarrollan de estas alteraciones surgen de dos a cuatro años después de iniciada la lesión; incluso algunos consideran que este proceso puede durar décadas. El tiempo estimado para la progresión depende de la severidad de la displasia epitelial, se calcula aproximadamente 58 meses para la ligera, 38 meses para la moderada y 12 meses para la severa (30 – 32).
Teniendo en cuenta lo antes expuesto, el predominio de displasia epitelial ligera encontrada en nuestro trabajo, puede deberse a que dentro del programa de salud vigente en Cuba, existe un Programa de Detección del Cáncer Bucal (33), que permite que la mayoría de los pacientes sean diagnosticados en las fases iniciales de la enfermedad.
Displasia epitelial y parámetros clínicos
En general, las variables clínicas (edad, sexo, color de la piel y localización topográfica de la lesión) son factores importantes, aunque no determinantes en la evolución de la displasia epitelial y la ausencia de relación significativa entre los grados de displasia epitelial y estos parámetros, podría deberse a que el grado histológico de severidad de la displasia epitelial depende de otros aspectos como son: el tabaco, el alcohol, las infecciones virales y los traumas mecánicos intrabucales como principales factores de riesgo asociados a la leucoplasia bucal.
Displasia epitelial y parámetros histopatológicos
Tipo de queratinización
La relación significativa entre el patrón de queratinización y el aumento progresivo en severidad del grado de severidad de la displasia epitelial, se traduce en un incremento del recambio celular de forma descontrolada, con una pérdida de la capacidad de diferenciación celular (6, 34 – 37).
Es probable que nuestros resultados estén en relación con el proceso de carcinogénesis química epitelial, caracterizado por fases progresivas de transformaciones moleculares y celulares, que van desde las alteraciones no reparadas del ADN, con replicación del mismo, de forma tal que el cambio del ADN pase a ser fijo o permanente, hasta la aparición escalonada de subpoblaciones celulares que difieren en varios atributos fenotípicos, como lo son la capacidad de invasión y la velocidad de crecimiento (6, 38).
Por lo anteriormente expuesto, es que en la displasia ligera, pudieran encontrarse subpoblaciones de células mutadas, con un grado de proliferación ligeramente aumentado y de diferenciación celular similar al de los queratinocitos normales, lo que desencadenaría un proceso de queratinización completa, caracterizado por una banda superficial acidófila, homogénea y sin núcleos, típica de la ortoqueratosis; y ya a nivel de las displasias moderadas y severas, aumentaría este nivel de proliferación de células mutadas, caracterizadas por presentar un mayor nivel de proliferación de células mutadas, caracterizadas por un mayor nivel de indiferenciación celular, lo que se traduce en el desarrollo de una capa superficial de células mucho más acidófilas y aplanadas con núcleos picnóticos, característico de la paraqueratosis.
Infiltrado inflamatorio
La presencia del infiltrado en las lesiones displásicas, es un indicador importante de la existencia de defensa inmunológica, se conoce que las lesiones premalignas pueden provocar una florida reacción inflamatoria, al desencadenarse el proceso de carcinogénesis química antes mencionado, este sistema de respuesta inmunológica está dado por una reacción subepitelial e interepitelial en los focos de displasia epitelial, presumiblemente de células que presentan moléculas del HMC clase I, este fenómeno evocaría una especie de rechazo, poniendo en marcha los diversos mecanismos de la inmunidad, sobre todo los de inmunidad mediada por células, en la que participan fundamentalmente los linfocitos T citotóxicos, macrófagos activados y las células NK, estas últimas son linfocitos capaces de destruir las células tumorales sin necesidad de sensibilización previa, tras su activación por la IL 2, y de lisar a una serie de tumores que parecen no ser inmunogénicos para las células T citotóxicas (6, 38).
Como aproximadamente el 90% de los carcinomas epidermoides bucales son bien diferenciados, caracterizados por células neoplásicas que expresan moléculas de clase I, con un elevado potencial inmunogénico, capaz de provocar una elevada respuesta inflamatoria (6, 38 – 40). Es probable que el aumento de la intensidad del infiltrado inflamatorio, a medida que se incrementa el grado de severidad de la displasia epitelial, encontrada en nuestra casuística, se deba al incremento progresivo de célula mutadas que expresan estas mismas moléculas, a la vez que se desarrolla el proceso de carcinogénesis epitelial.
Displasia epitelial y p53
Numerosos estudios han demostrado que la p53, es la proteína de control del ciclo celular mejor caracterizada (14 – 19). Las mutaciones en este gen parecen ocurrir en etapas tempranas de ciertas neoplasias, como el carcinoma epidermoide bucal, donde se ha observado que la frecuencia de sobrexpresión de dicha oncoproteína es la más alta (43-93%) entre todos los cánceres humanos, lo que puede estar relacionado con la exposición mantenida de la mucosa bucal a agentes ambientales, como son el tabaco y el alcohol.
Hoy se ha demostrado que por cada cigarrillo consumido se producen entre 20 y 40 nanogramos de benzoapireno, un hidrocarburo aromático policíclico muy cancerígeno, debido a que uno de sus derivados metabólicos, en su forma química de epóxido, se enlaza al genoma humano, en ciertos lugares específicos del gen p53, provocando las inmediatas modificaciones o mutaciones del gen, con lo que se impide la participación del mismo en la lucha contra el proceso de malignización celular (41). Esto explicaría por qué en nuestro estudio encontramos tan elevada frecuencia de la sobrexpresión de dicha oncoproteína en los casos de carcinoma epidermoide bucal.
El tejido con una apariencia normal o benigna [displasia ligera] puede también contener cambios genéticos tempranos que no necesariamente se correlacionan con alteraciones observables en la morfología, lo que ocurre en fases tempranas de la carcinogénesis, incrementándose la proporción de células inmunorreactivas, a medida que aumenta el grado de severidad de la displasia epitelial.
Estudios recientes sugieren que en la progenie de células displásicas, un clon de queratinocitos, pasa por estadios de transformación en cada etapa, hasta que la acumulación de daños genéticos es suficiente para la proliferación y formación del tumor (21, 42, 43).

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El 23/3/2004 12:13, LIC; ISABEL BROWN dijo:

El 25/3/2004 17:41, Dra. Zenia Batista dijo: